吴子健 吴桂玲 陈达婷 苏澜 陈春蓉 叶锦霞 洪振强
【摘 要】意图：探求巴戟天-牛膝醇提物（M-AAE）对体外培育的SD大鼠软骨细胞G1/S周期蛋白与mRNA含量表达的影响，为其防治骨关节炎的临床运用供给根据。办法：①用乙醇加热回流法取得其醇提物成分；选用机械-酶消化法别离SD大鼠膝关节处的关节软骨，树立体外培育细胞模型并进行判定；②MTT法检测M-AAE对软骨细胞增殖特性的影响，运用倒置相差显微镜镜下调查软骨细胞状况；③PCR、Western blot法别离检测体外培育大鼠软骨细胞经M-AAE的0，75，150，300 μg·mL-1 DMEM溶液干涉48 h后的mRNA、蛋白含量的表达。成果：①软骨细胞经Ⅱ型胶原法染色后，阳性对照组胞浆区域浸染为棕黄色；②经MTT检测M-AAE对软骨细胞增殖具有必定的时效-量效联系，其最佳干涉时刻和浓度别离为48 h和150 μg·mL-1；③M-AAE干涉软骨细胞后，各加药组细胞周期蛋白依赖性激酶-4（CDK4）、细胞周期蛋白D1 （Cyclin D1）的mRNA与蛋白含量的表达量均显着高于0 μg·mL-1组，其间以150 μg·mL-1组的表达量最高（P < 0.01），75 μg·mL-1组和300 μg·mL-1组在CDK4及Cyclin D1 mRNA上比较，其表达量差异无统计学含义（P > 0.05）。定论：M-AEE可上调CDK4、Cyclin D1 mRNA及蛋白表达，对SD大鼠软骨细胞具有必定的促增殖效果。
【关键词】 骨关节炎；巴戟天；牛膝；醇提物；软骨细胞；增殖；大鼠
骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种临床常见的骨科退行性疾病，因为生物力学效果反常等叠加要素的影响，引起关节软骨代谢及修正功用失衡，进而加重关节软骨退变，形成关节危害。临床表现常以关节反复性痛苦、肿胀、活动妨碍为主。鉴于其发病周期长、致残率高级特色，对其防治具有重要现实含义[1-2]。现在，医治OA的办法很多，大致可分保存医治和手术医治两大类。其间，保存医治以药物为主，西医首要有口服和部分给药两种办法，前者因非甾体抗炎药等发作的胃肠道不良反响而运用受限，而后者可有感染风险且效果也十分有限；手术办法作为一种补救措施，因其并发症较多，影响要素杂乱，且术后需求长时刻恢复，远期效果有待进一步考证。中医药疗法医治具有多靶点、效果显著、副效果小、合适长时刻医治等优势[3]。
当时，在中医药领域，补肝肾祛风湿法在防治OA上运用广泛，并成为该领域研讨热门[4]。巴戟天、牛膝均具有补肝肾、祛风湿、强筋骨成效，是临床医治OA常用配伍药。巴戟天、牛膝的联用可追溯到《备急千金要方》记载的巴戟天酒，其合用可增强补肾强筋、祛风除痹之功效，医治肝肾亏虚型骨痹具有良性效果；别的源自《和平圣惠方》的巴戟丸亦由巴戟天和牛膝组方。因而，本研讨旨在调查药对巴戟天-牛膝醇提物（M-AAE）对体外培育大鼠软骨细胞周期蛋白与基因的影响，进而为其阐明防治OA的医治机制及临床运用供给试验支撑。
1 试验材料
1.1 试验动物 SPF级SD雄性大鼠16只，体质量90～100 g，由福建中医药大学试验动物中心供给，动物许可证号：SCXK2012-0001（闽）。
1.2 试验药物 中药材巴戟天和牛膝，均由福州回春中药饮片有限公司供给。
1.3 首要试剂 磷酸盐缓冲液（HyClone）；DMEM/LOW GLUCOSE（HyClone）；逆转录试剂盒、DNA Marker Ⅱ（北京全式金生物技能有限公司）；RT-PCR引物组成、CyclinD1、CDK4、β-actin引物（上海捷瑞生物工程有限公司）；TRIZOL（美国life）；异丙醇（国药集团药业股份有限公司）；无水乙醇（国药集团药业股份有限公司）；琼脂糖（Biowest Agarose）；核酸染料（Solarbio）；WB玻板（美国BIO-RAD）；PMSF（蛋白酶抑制剂）；RISF（裂解液）、蛋白上样缓冲液、1-StepTM Transfer Buffer、ECL高效显影液（Thermo）；质量分数为30%的聚丙烯酰胺、Tris（pH = 8.8与pH = 6.8）、SDS（十二烷基磺酸钠）、10×电泳液、AP（过硫酸铵）、TEMED、50×TAE（碧云天生物技能研讨所）；10×TBST（Solarbio）；高效关闭液（北京康为世纪生物科技有限公司）；一抗（兔抗）、CyclinD1 Antibody、Cdk4 Antibody（C-22，美国Santa Cruz Biotechnology）；二抗（羊抗兔，美国CST）等。
1.4 首要仪器 DNA扩增仪（9600型，美国PE）；低温高速离心机（64R型，美国BECKMAN）；旋转蒸腾仪（上海亚荣生化仪器厂）；超纯水设备（MILLI-Q型，美国MILIPORE）；荧光倒置相差显微镜（Olympus，日本TKO）；无菌操作台（AIRTECH型）、超净工作台（SW-CJ-1F型）（姑苏安泰空气技能有限公司）；凝胶成像体系（GELDOC2000型，美国BIO-RAD）；全自动酶标仪（BIO-TEK ELX800型，美国BIO-Tek）；CO2恒温培育箱（BB16/BB5060型，德国Heraus）等。
2 方 法
2.1 M-AAE的提取 称取巴戟天、牛膝各100 g，顺次经破坏、筛检后移入装有500 mL质量分数为50%乙醇的烧瓶中浸渍7 d，搜集上清液；再参加500 mL质量分数为50%乙醇，依法浸渍7 d，再次搜集上清液；第3次参加500 mL质量分数为50%乙醇，继续浸渍7 d后搜集上清液，终究兼并3次浸出液，静置24 h，过滤，浓缩，回旋蒸腾乙醇，97 ℃水浴锅继续蒸干水分，即得M-AEE提物浸膏。后置于烘干箱繼续蒸干，待低温下研磨成粉末状。试验用时进行准确称量，并运用DMEM在低频超声下溶解，再经0.22 μL无菌滤嘴滤往后4 ℃冰箱保存备用。
2.2 软骨细胞的别离、培育与判定 在麻醉状况下进行脱颈椎处死SD大鼠，每次3只，别离膝关节处关节软骨。搜集并剪碎至1 mm3/单位体积，PBS缓冲液冲刷至少3次后移至无菌小培育皿中，按每个器皿2.5 mL的体积参加质量分数为0.2%的Ⅱ型胶原酶进行消化，15 mL离心管搜集消化后的上清液（每次2 h），1500 r·min-1离心机离心后弃上清液，移液器代液（含质量分数为10%胎牛血清DMEM）状况缓慢吹匀沉积。经计数板计数（2×105·mL-1）后栽培原代软骨细胞于培育瓶进行培育，48 h后初度换液。镜下调查细胞铺满80%瓶底面积时，经胰酶消化进行细胞传代。本试验运用第2代软骨细胞[5]。
Ⅱ型胶原免疫组织化学染色：软骨细胞（经计数每毫升2500个）待爬片后，经PBS冲刷3次，质量分数为4%的多聚甲醛固定30 min。再经冲刷、裂解（质量分数为0.1%的破膜剂50 μL）20 min，冲刷后参加50 μL质量分数为3%的H2O2反响
20 min。再次冲刷后经5% BSA关闭30 min，设置阳性对照组、阴性对照组。阳性对照组参加含Ⅱ型胶原1∶200的一抗反响过夜，阴性对照组参加PBS作为对照。后经PBS冲刷3遍后参加50 μL二抗（1∶200）反响30 min，再次冲刷后以每张玻片50 μL DAB进行滋润10 min。再顺次经过漂洗、苏木素复染、冲刷（PBS）、返蓝2 s、常温晒干、梯度酒精、二甲苯进行脱水与通明后封片调查[6]。
2.3 MTT测定M-AAE干涉后软骨细胞增殖活性
以96孔板为载体培育经计数为每孔2×103的第
2代软骨细胞24 h后，再饥饿细胞同步培育24 h，
弃去旧液替换含质量分数为10%的胎牛血清DMEM培育，符号分组后顺次参加0，75，150，300，600 μg·mL-1浓度的M-AEE别离培育24，48，72 h。后续操作顺次为：弃净每孔旧液、
37 ?C温箱MTT（每孔100 μL）反响5 h、二甲基亚砜（DMSO）振动条件下反响10 min（每孔100 μL）、
酶标仪570 nm波长下检测每孔OD值、记载与剖析。
2.4 M-AEE干涉软骨细胞活性镜下调查 软骨细胞的别离和培育，选取试验所需细胞，经0，75，150，300 μg·mL-1浓度的总醇提物DMEM溶液干涉48 h后，运用光镜调查。
2.5 RT-PCR法检测CDK4、Cyclin D1 mRNA表达
2.5.1 CDK4、Cyclin D1 mRNA引物规划与组成见表1。
2.5.2 RT-PCR办法 运用核酸蛋白检测仪检测所提Total RNA浓度，当A260/A280比值在1.8～
2.0时，标明本试验所提取的软骨细胞Total RNA纯度较高。然后进行RNA逆转录反响，制备质量分数为1.5%的琼脂糖凝胶。成胶后取出浸入电泳槽，加TAE（1×）电泳缓冲液，扫除气泡。取上述各组RNA 每孔5 μL、Marker 每孔4.5 μL，电泳条件为100 V、70 mA、15 min，运用BIO-RAD Fluor-S TM Multi Imager图象剖析仪下扫描，经剖析后摄影存档。
2.6 Western Blot检测CDK4、Cyclin D1蛋白含量 设置分组（0，75，150，300 μg·mL-1组），经M-AAE干涉48 h后，顺次经PBS冲刷后吸净、参加裂解液（含100∶1蛋白酶抑制剂PMSF）、搜集经刮刀刮取的细胞后离心取上清进行蛋白提取，参照碧云天生物技能研讨所出产的BCA蛋白浓度检测试剂盒阐明进行定量；制备质量分数为12%别离胶与质量分数为5%浓缩胶进行灌板，按每孔50 μg量計算上样体积后顺次参加，蛋白Marker参加每孔5 μL，在恒流下以20 V电压先跑10 min，再调整到100 V电压跑至别离胶底部进行电泳；调整电流为1.3 A、电压25 V，本试验中以β-actin耗时为7 min、CDK4为5 min、Cyclin D1为5 min进行半干式转膜，再经TBST中漂洗、关闭、洗膜、一抗过夜（1∶1000浓度的β-actin、CDK4、Cyclin D1）、TBST漂洗、二抗（1∶5000）关闭后洗膜进行显影。
2.7 统计学办法 选用SPSS 17.0软件进行统计剖析。计量材料以标明，选用t查验和单要素方差剖析。以P < 0.05为差异有统计学含义。
3 结 果
3.1 软骨细胞调查与判定 第2代软骨细胞镜下调查：散布均匀，鸿沟明晰，形状结构共同，呈显着的铺路石状外观；经Ⅱ型胶原免疫组化染色后，阳性对照组胞浆区为棕黄色，阴性对照组胞浆区色彩通明。以上可判定本试验所用细胞为软骨细胞。见图1。
3.2 M-AEE对软骨细胞增殖的时效与量效联系 用MTT法检测M-AAE在不同浓度（0，75，150，300，600 μg·mL-1）及不同时刻（24，48，72 h）对软骨细胞增殖特性的影响。与0 μg·mL-1组比较，24，48，72 h的OD值均有升高，其间以48 h与150 μg·mL-1条件下软骨细胞增殖显着，差异有统计学含义（P < 0.01）。进而估测M-AAE干涉软骨细胞后，对其增殖具有必定的时效-量效联系。其最佳干涉时刻和浓度别离为48 h和
150 μg·mL-1。见表2。
3.3 M-AEE干涉软骨细胞活性镜下调查 经0，75，150，300 μg·mL-1浓度的总醇提物DMEM溶液干涉48 h后，行光镜下调查：0 μg·mL-1浓度下调查细胞外观形似扁平状，胞浆丰厚，胞核明晰，具有1～2个核仁，细胞数目较少，见图2（1）；经75 μg·mL-1浓度干涉后，细胞散布均匀，大部为扁平状、细胞状况较好且细胞数量较多，见图2（2）；经150 μg·mL-1浓度干涉后，软骨细胞紧贴集组成长，外观以扁平状为主，鸿沟明晰，形状结构共同，细胞核明晰、丰满，细胞状况佳，细胞数目最多，见图2（3）；经300 μg·mL-1浓度干涉后，细胞数目较多但细胞核不规则，培育基中漂浮细胞较多，细胞状况欠佳，见图2（4）。
3.4 RT-PCR检测成果 M-AAE干涉软骨细胞后，各加药组CDK4、ClinD1的mRNA的表达量均显着高于0 μg·mL-1组，其间以150 μg·mL-1组的表达量最高（P < 0.01）。75 μg·mL-1组和300 μg·mL-1
组在CDK4及Cyclin D1 mRNA上比较，其表达量差异均无统计学含义（P > 0.05）。见图3。
3.5 Western blot检测成果 M-AAE干涉软骨细胞后，各加药组CDK4、ClinD1蛋白表达量显着高于0 μg·mL-1组，其间以150 μg·mL-1组的表达量最高（P < 0.01）。75 μg·mL-1组和300 μg·mL-1
组比较，在Cyclin D1和CDK4指标上，其蛋白含量的表达差异无统计学含义（P > 0.05）。见图4。
4 讨 论
OA属中医学“骨痹”领域，其病机首要在于“天癸竭，形体衰”导致肝肾亏虚，进而加重筋骨失养，终究表现为关节晦气、痛苦纠缠。根据“肾主骨、肝主筋”“肝肾同源”理论，肾精足够则肝血充盈，肝血得到濡养则能化精，肾精方可充溢，由此可见，肾中精气的气化与肝血的化生存在互生互利的密切联系。鉴于OA的病位在“肝肾”而外现于“筋骨”，故经过补肝肾、祛风湿法使经络灵通，则肝肾精华得以濡养筋骨，然后驱赶停留关节外邪，以达通利关节之效[7]。巴戟天、牛膝则以其补肝肾、祛风湿的效果全体切合OA的病机。现代药理研讨发现，巴戟天首要化学成分有糖类、蒽醌类、环烯醚萜苷类、有机酸类、微量元素、氨基酸和甾醇类等，具有改进机体免疫功用、抗氧化、健壮骨骼、抗炎镇痛补血及促进造血干细胞增殖和分解等效果[8-10]。牛膝作为临床医治OA常用药物，可引经下行，医治OA发挥重要效果，研讨标明，其首要成分有皂苷、脱皮甾酮、牛膝甾酮及糖类物质，并具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗凝血等效果[11-13]。
鉴于细胞生机与细胞数呈正相关性，本试验首要运用MTT比色法检测狗脊多糖在不同浓度下对体外培育SD大鼠软骨细胞活性效果的影响，成果显现，M-AAE对软骨细胞增殖的影响与其药物浓度和时刻有关，其最佳时效-量效联系为48 h和150 μg·mL-1；软骨细胞可发作有丝分裂，发作子代软骨细胞，以此保持关节功用趋于稳定。鉴于细胞有丝分裂的表现形式相似圆周循环，即具有周期性，一般称之为细胞周期，而对其调控发挥首要效果的内源性途径首要由细胞周期蛋白（Cyclin）、细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）等组成，两者的协同效果可直接推进骨细胞跨过坐落DNA组成开始部的G1/S
周期，进而决议细胞分裂，然后影响细胞增殖成果[14-15]。故本研讨根据G1/S周期的CDK4、Cyclin D1的正性调理效果，开始讨论M-AAE对体外培育大鼠软骨细胞的影响，成果发现，与0 μg·mL-1组比较，M-AAE在必定条件下可上调CDK4、Cyclin D1 mRNA及蛋白表达，差异有统计学含义（P < 0.05或P < 0.01）。进而提示M-AAE可经过促进软骨细胞G1/S期的改变，加快细胞分裂，对软骨细胞增殖具有正性调控效果，然后为其在临床运用于OA供给相关根据。
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收稿日期：2016-10-10；修回日期：2016-11-30
