庞学丰 蒙宇华
【摘 要】意图：调查清热解毒抗风湿方药——热痹康汤对胶原诱导性关节炎（CIA）大鼠滑膜P38/核转录因子-κB（NF-κB）信号通路的影响。办法：将60只SPF级雌性Wistar大鼠随机分为空白对照组，模型对照组，热痹康汤低、中、高剂量组，甲氨蝶呤组，每组10只。除空白对照组外，其他各组大鼠选用弗氏不彻底佐剂乳化的牛Ⅱ型胶原蛋白诱导CIA大鼠模型。造模成功后开端给药，模型对照组予生理盐水灌胃，热痹康汤低、中、高剂量组别离给予热痹康汤提取物低、中、高剂量灌胃，甲氨蝶呤组给予甲氨蝶呤腹腔打针，空白对照组大鼠自在饮水和进食。调查不同剂量热痹康汤对CIA大鼠滑膜P38/NF-κB信号通路的影响。成果：热痹康汤能下调CIA大鼠滑膜P38/NF-κB信号通路相关分子P38 MAPK、NF-κB/P65、IκBα的表达。定论：热痹康汤医治类风湿关节炎的效果与按捺滑膜P38/NF-κB信号通路有关。
【关键词】 胶原诱导性关节炎；关节炎，类风湿；热痹康汤；P38 MAPK；NF-κB；大鼠
【ABSTRACT】Objective：To observe the effect of Rebikang Tang（热痹康汤）on the P38/NF-κB signal pathway in synovial membrane of rats with arthritis induced by collagen（CIA）.Methods：Sixty female Wistar rats of grade SPF were randomly divided into a blank control group，a model control group，low，middle and high dose Rebikang groups，and a methotrexate group，10 rats in each group.Except the blank control group，the rats in the other groups were induced by typeⅡ collagen to establish CIA rat models.Rat models in the model control group were given intragastric administration of physiological saline.Models in the low，middle and high dose Rebikang groups were given intragastric administration of low，middle and high dose of Rebikang Tang.Rat models in the methotrexate group were given intraperitoneal injection of methotrexate.Rats in the blank control group were only fed with water and food.Effect of Rebikang Tang on the P38/NF-κB signal pathway in each group was observed.Results：Rebikang Tang could down-regulate the expression of related molecules P38 MAPK，NF-κB/P65 and IκBα of the P38/NF-κB signal pathway in synovial membrane of CIA rats.Conclusion：The role of Rebikang Tang in the treatment of rheumatoid arthritis is related to the inhibition of the P38/NF-κB signal pathway in synovial membrane.
【Keywords】 collagen-induced arthritis；arthritis，rheumatoid；Rebikang Tang（热痹康汤）；P38 MAPK；NF-κB；rats
类风湿关节炎（rheumatoed arthritis，RA）的病因迄今没有彻底清晰，未经体系规范医治将会呈现关节损坏和功用损失。核转录因子-κB（NF-κB）作为信号转导的纽带，在RA等免疫相关性疾病的发病进程中发挥重要效果，而P38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）在该细胞信号传导通路中起着重要的中介效果，或许成为RA医治的新靶点。本试验拟经过热痹康汤对CIA大鼠滑膜细胞P38/NF-κB信号通路影响的研讨，进一步清晰其医治RA的效果原理。
1 试验材料
1.1 试验动物 试验用SPF级雌性Wistar大鼠
60只，体质量（110±10）g，购自广西中医药大学试验动物中心，动物合格证号：桂医动字第11005号。不约束饮水和进食，适应性鼠颗粒饲料养殖1周后，按计划进行各项试验。
1.2 试 剂 牛Ⅱ型胶原蛋白（南京奥多福尼生物科技有限公司）；不彻底弗氏佐剂（美国Sigma公司）；P38 MAPK、NF-κB/P65、IκBα检测试剂盒（瑞士Roche公司）；水合氯醛（美国Life technologies公司）；冰醋酸[生工生物工程（上海）有限公司]。
1.3 试验药物 打针用甲氨蝶呤（MTX，5 mg，广州岭南制药有限公司，国药准字H20054692）。热痹康汤提取物（RBK）是运用乙醇对热痹康汤（秦艽10 g、防风10 g、桂枝4 g、威灵仙15 g、制川乌6 g、地龙10 g、桑枝10 g、葛根15 g、忍冬藤20 g、青风藤10 g、黄柏10 g、苍术10 g）进行萃取、溶解并提取上清液制成，试验前按份额参加乙醇和生理盐水进行溶解制造备用，详细由本院新药研制中心制备。
2 方 法
2.1 试验造模及分组 将一切大鼠放置于鼠笼中进行适应性养殖，调查7 d后随机分为空白对照组，模型对照组，热痹康汤低、中、高剂量组，MTX组，每组10只。除空白对照组外，其他各组大鼠参照文献[1]办法顺次进行试验造模：在无菌试验条件下，用冰醋酸充沛溶解牛Ⅱ型胶原蛋白（操作于冰面上进行），随后把它和等体积的弗氏不彻底佐剂一同注入医用三通管内，用打针器相互推吸充沛混合乳化成油包水状，即成CⅡ乳剂，放置4 ℃冰箱保存过夜备用。进行造模时，别离于大鼠背、尾部皮内多点打针CⅡ乳剂，14 d后再次打针CⅡ乳剂进行免疫（办法和剂量同前）。评分在4分以上，大鼠四肢足爪均严峻肿胀、踝关节直径增长幅度≥2 mm则为造模成功。本次试验中大鼠造模悉数成功，而且没有逝世大鼠。
2.2 药物干涉 造模成功后开端给药，模型对照组予生理盐水2 mL·（100 g）-1灌胃，每日
1次；MTX组以MTX 5 mg溶于10 mL生理盐水为
0.5 mg·mL-1，按70 kg人体质量与200 g大鼠换算系数为0.018，按MTX每周1.9 mg·kg-1腹腔打针给药；热痹康汤高剂量组予RBK31.25 g·（100 g）-1·d-1
灌胃，中剂量组予15 g·（100 g）-1·d-1灌胃，低剂
量组予7.5 g·（100 g）-1·d-1灌胃，每日分2次进行；空白对照组大鼠自在饮水和进食。
2.3 选材及安排处理 28 d后，一切大鼠以水合氯醛进行腹腔打针，敏捷麻醉后颈椎脱臼法处死，逐层别离膝关节各层安排，翻开关节腔，可见由髌骨下极向下连续有一层浅淡黄色滑润亮光的滑膜安排，用手术刀片当心切下，再用眼科直镊进行钝性别离并完好剥离滑膜安排，冰冻保存备测。
2.4 P38和NF-κB检测 试验中选用Western blot 法顺次检测各组大鼠关节滑膜细胞P38MAPK、NF-κB/P65、IκBα的表达，一切操作严厉依照说明书进行，进程如下：于低温下将各组大鼠关节滑膜安排进行匀浆，随后参加适量蛋白裂解液，放置于冰上40 min，置入12 000 r·min-1离心机进行离心后取上清。以BSA 为规范对照，使用Bradford 法对上清进行蛋白定量。选取20 μg蛋白样品，10% SDS-PAGE电泳，100 V搬运1 h至硝酸纤维素薄膜上，一同放入关闭液中37 ℃关闭1 h；一抗4 ℃过夜。试验中选用不含抗体TBS-T液孵育作为阴性对照。屡次重复洗膜后，将膜与碱性磷酸酶符号的抗IgG抗体进行孵育，悄悄摇摆1 h（室温下进行），再次洗膜后，用Western blot印迹进行调查研讨，最终选用图画剖析测定各带吸光度（A）值作定量剖析，作出成果判别。
2.5 统计学办法 选用SPSS 17.0软件进行统计剖析。计量材料以标明，选用方差剖析或t查验对各组间材料进行比较。以P < 0.05为差异有统计学含义。
3 结 果
与空白对照组比较，模型对照组大鼠的滑膜细胞P38 MAPK、NF-κB/P65、IκBα的表达量均有不同程度的升高（P < 0.05）。与模型对照组比较，热痹康汤各医治组与MTX组大鼠滑膜细胞P38 MAPK、
NF-κB/P65的表达量均有下降（P < 0.05或P < 0.01）。低剂量RBK对大鼠滑膜细胞IκBα无显着按捺效果，高、中剂量RBK与MTX对大鼠滑膜细胞IκBα的表达均有按捺效果。见图1、表1。
4 讨 论
RA的发病进程中存在着很多细胞因子的参加，P38/NF-κB信号通路在细胞因子的激活进程中起着“开关”效果，研讨标明，P38 MAPK是炎性细胞应对进程中最重要的宗族成员之一，
P38 MAPK信号传导通路可被多种影响因子激活，可参加细胞的多种生理进程[2]。研讨材料证明，P38 MAPK可调控与RA骨腐蚀有关的破骨细胞的
分解[3]。
NF-κB与按捺物IκB结合今后存在于细胞质傍边，但其自身没有活性，首要经过降解IκB而激活[4]。NF-κB活化后发动炎症递质基因的转录，诱导IκB的表达增强，重生的IκB进入细胞核后与NF-κB反响，使NF-κB从DNA上解离并搬运到胞浆中，变成无活性状况，IκB还与游离的NF-κB结合，按捺其活化[5]。研讨标明，体内NF-κB信号通路的活化进程调控是经过经细胞外的正反馈途径以及经细胞内、外的负反馈途径完成的[6]。
NF-κB的调控与活化在RA的病理变化占有重要位置。在RA发病的进程中，肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-1、IL-2、IL-8等致炎细胞因子均是经过NF-κB信号通路，激活相关因子，参加免疫应对进程，诱发炎症反响，导致关节的损害。本次试验研讨发现，在致炎后的胶原诱导性关节炎大鼠中NF-κB的活性显着升高，成果提示，NF-κB参加了胶原诱导性关节炎的炎症调控进程。有研讨标明，NF-κB表达添加与MAPK信号传导体系有关，如TNF-α和IL-1等经过与细胞膜上的受体结合，进而激活中性鞘磷脂酶，再进一步活化神经酰胺活化蛋白而激活MAPK通路，诱导NF-κB的表达而发生炎性因子[7]。因而，按捺P38/NF-κB信号通路的活化成为RA新的医治
靶点。
RA属中医学“痹病”“历节病”等领域，多因禀赋缺乏，人体正气亏虚，卫外不固，或病后、产后腠理疏松，感触湿热之邪，痹阻肌肉、经络，气血凝滞而致。本虚标实是本病的病理性质，本虚为气血、阴阳、脏腑亏本，标实为外受湿热之邪。热痹康汤是笔者根据多年临床领会总结的经验方，具有清热解毒、利湿除痹止痛成效，前期临床使用标明具有较好的效果，无显着毒副效果[8]。前期课题研讨发现，热痹康汤能下降CIA大鼠血清IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α及基质金属蛋白酶-3水平，升高IL-4、IL-10的水平[9-12]。
本研讨成果提示，热痹康汤对P38 MAPK、NF-κB/P65以及IκBα的表达均有按捺效果，其按捺效果呈剂量依靠型，能下调CIA大鼠滑膜P38/NF-κB信号通路的表达，这一研讨成果为热痹康汤对RA的靶向医治及临床研讨供给必定的试验根据。
5 参考文献
[1] 邓安梅，仲人前，陈孙孝，等.关节炎中B7：CD28/CTLA-4共影响途径的试验研讨[J].我国免疫学杂志，2000，16（8）：412-414.
[2] Chabaud-Riou M，Firestein GS.Expression and activation of mitogen-activated protein kinase kinases-3 and -6
in rheumatoid arthritis[J].Am J Pathol，2004，164（1）：177-184.
[3] Pargellis C，Regan J.Inhibitors of p38 mitogen-activated protein kinase for the treatment of rheumatoid arthritis[J].
Arrop in Ivest Drugs，2003，4（5）：566-571.
[4] May MJ，Ghosh S.Signal transductin through NF-κB[J].Immunol Today，1998，19：80-88.
[5] Lee EG，Boone DL，Chai S，et al.Failure to regulate TNF-α induced NF-κB and death responses in A20 deficient mice[J].Science，2000，289（5488）：2350-2534.
[6] Koul D，Yao Y，Abbruzzese JL，et al.Tumor suppressor MMAC/PTEN inhibits cytokine-induced NFkappa B activation without interfering with the IkappaB degradation pathway[J].J Biol Chem，2001，276（14）：11402-11408.
[7] Han Z，Boyle DL，Manning AM，et al.AP-1 and NF-kappaB rgulation in rheumatoid arthritis and murine collagen induced arthritis[J].Autoimmunity，1998，28（4）：197-208.
[8] 庞学丰，蒙宇华.热痹康胶囊医治湿热型类风湿性关节炎86例[J].广州中医药大学学报，2003，20（2）：106-108.
[9] 刘欢，庞学丰.热痹康汤对试验性关节炎大鼠血清IL-2及IL-10的影响[J].广西中医药，2010，33（1）：48-50.
[10] 刘欢，庞学丰，吴燕红，等.热痹康汤对胶原诱导性关节炎大鼠血清IL-1β及IL-4的影响[J].江西中医学院学报，2012，24（1）：55-57.
[11] 庞学丰，龙向阳，刘欢，等.热痹康汤对胶原诱导性关节炎大鼠血清TNF-α及IL-6的影响[J].广西中医药，2012，35（2）：51-52.
[12] 庞学丰，李玉玲，刘欢，等.热痹康汤对胶原诱导性关节炎大鼠血清基质金属蛋白酶-3的影响[J].风湿病与关节炎，2013，2（4）：32-34.
收稿日期：2016-08-24；修回日期：2016-09-22
