李宜川 刘国玲 芦琨 常景芝 刘青 郭娅丽
【摘 要】意图：调查川芎嗪（TMP）对胶原性关节炎（CIA）大鼠滑膜安排细胞的增殖、凋亡及滑膜安排中p53表达的影响，并进一步讨论其医治类风湿关节炎的或许机制。办法：将50只SD大鼠随机分为正常对照组10只和模型组40只。模型组选用Ⅱ型胶原诱导大鼠CIA模型，36只大鼠造模成功。将造模成功的36只大鼠随机分为模型对照组、地塞米松组、TMP高剂量组和TMP低剂量组，每组9只。正常对照组和模型对照组给予2 mL·kg-1生理盐水肌肉打针，地塞米松组给予地塞米松2 mg·kg-1肌肉打针，TMP高剂量组肌肉给药TMP 100 mg·kg-1，TMP低剂量组肌肉给药TMP 50 mg·kg-1。调查
CIA大鼠足肿胀度与关节炎指数，MTT法检测TMP对CIA大鼠足关节滑膜细胞增殖的影响，碱性磷酸酶标记法检测CIA大鼠足关节滑膜细胞凋亡，免疫组化法检测CIA大鼠足关节滑膜细胞p53表达。成果：TMP高剂量组大鼠足爪肿胀程度峰值下降，关节炎指数下降（P < 0.01）；TMP（100 mg·kg-1）可按捺CIA大鼠关节滑膜细胞的增殖，增高大鼠滑膜细胞凋亡积分（P < 0.01），显着下降p53表达（P < 0.01）。定论：TMP（100 mg·kg-1）可按捺CIA大鼠的足爪肿胀和多发性关节炎，对CIA大鼠具有明顯的医治效果；其机制或许是经过下降CIA大鼠滑膜细胞p53的反常表达水平，促进滑膜细胞凋亡，按捺关节滑膜细胞增殖，减轻部分缓慢炎症反响，然后对CIA大鼠发挥医治效果。
【要害词】 关节炎，类风湿；胶原诱导性；川芎嗪；滑膜细胞；增殖；凋亡；p53；大鼠
【ABSTRACT】Objective：To observe the effect of tetramethylpyrazine（TMP）on the proliferation，apoptosis of synovial cells and the expression of p53 in synovial tissue of rats with collagen induced arthritis and further explore its possible mechanism in the treatment of rheumatoid arthritis.Methods：Fifty SD rats were randomly divided into a normal control group（10 rats）and a model group（40 rats）.The model group was induced by type Ⅱ collagen to establish 36 CAI rat models which then were randomly divided into a model control group，a dexamethasone group，a high-dose TMP group and a low-dose TMP group，with 9 rats in each.The normal control group and the model control group were given an intramuscular injection of 2 mL·kg-1 of physiological saline.The dexamethasone group was given an intramuscular injection of 2 mg·kg-1 of dexamethasone.The high-dose TMP group and the low-dose TMP group were medicated to muscles respectively 100 mg·kg-1 and 50 mg·kg-1of TMP.The foot swelling and arthritis index of the CIA rats were observed.MTT method was used to detect the influence of TMP on the proliferation of synovial cells of CIA foot joints.Alkaline phosphatase labeling was used to detect the apoptosis of synovial cells in the foot joints of CIA rats.The immunohistochemistry method was used to detect the expression of p53 in the synovial cells in foot joints of CIA rats.Results：The paw swelling peak and arthritis index decreased in the high-dose TMP group（P < 0.01）；TMP（100 mg·kg-1）could inhibit the proliferation of synovial cells in CIA rats，increase apoptosis integral of synovial cells（P < 0.01），and significantly reduce the expression of p53（P < 0.01）.Conclusion：TMP（100 mg·kg-1）can inhibit the paw swelling of CIA rats and polyarthritis and has an obvious therapeutic effect on CIA rats，whose treating mechanism may be through reducing the abnormal expression of p53 in synovial cells of CIA rats，promoting apoptosis of synovial cells，inhibiting synovial cell proliferation and reducing the local chronic inflammation reaction.
【Keywords】 arthritis，rheumatoid；collagen inducibility；tetramethylpyrazine；synovial cells；proliferation；apoptosis；p53；rats
类风湿关节炎（rheumation arthritis，RA）是以晨僵、关节胀痛、活动受限为首要临床体现，以关节滑膜为靶器官的本身免疫性疾病，以缓慢滑膜炎、滑膜细胞增生、骨质与软骨损坏为首要病理特征，终究导致劳累关节发作变形而呈现关节废用、致残，严峻影响患者的日子质量。RA的发病与细胞因子、遗传、感染等多种要素有关[1]，因为其发病机制还不彻底清晰，对其防治就显得非常困难。前期的非甾体抗炎药、糖皮质激素以及各种新式抗RA药物都存在着许多不良反响，使患者难以承受。川芎嗪（TMP）是从川芎的生物碱中别离得到的有用单体，具有活血行气、按捺血小板集合、按捺血管内皮细胞增殖、按捺RA炎症因子排泄、避免本身抗体的很多发作和抗肿瘤等效果[2-3]。张利省等[4-5]将TMP用于医治RA，效果显著。但其效果机制没有清晰报导。有研讨报导，RA关节滑膜安排增生的原因与滑膜细胞凋亡机制妨碍引起滑膜细胞增殖和凋亡之間的失衡有关[6]。本试验在成功树立大鼠胶原性关节炎（collagen-induced arthritis，CIA）模型的基础上，经过调查CIA大鼠关节炎的改变，检测CIA大鼠足关节滑膜细胞增殖、凋亡和滑膜安排中p53的表达，讨论TMP医治RA或许的效果途径，为TMP的进一步开发、使用及更有用的临床医治供给试验根据。
1 试验材料
1.1 试验动物 健康SD大鼠50只，清洁Ⅱ级，鼠龄3个月，男女参半，体质量160～180 g，由山西医科大学试验动物中心供给，动物许可证号：SCXK（晋）20150001。大鼠分笼养殖，专人办理，自在摄食和饮水，养殖环境温度22～24℃，相对湿度为40%～60%。
1.2 试 剂 磷酸川芎嗪片（无锡市第七制药厂）；弗氏彻底佐剂、鸡Ⅱ型胶原（上海本草生物医学工程所）；胎牛血清（FBS）、胰酶（EDTA）、DMEM培育基、PBS（Sigma公司）；MTT、二甲基亚砜（DMSO）（Gibco公司）。
1.3 仪 器 WD-9409型超净工作台（北京六一仪器厂）；80-2型离心机（上海手术器械厂）；CO2培育箱（德国Heraeus公司供给）；EL30型酶标仪（美国Bio-Tek公司）；倒置显微镜（Olympus公司）。
2 方 法
2.1 CIA大鼠模型的制备及用药 试验用大鼠50只，随机分为正常对照组10只和模型组40只。模型组选用Ⅱ型胶原诱导CIA大鼠模型，办法为将鸡CⅡ和等体积弗氏彻底佐剂混合充沛乳化后，制成胶原质量分数为1 mg·mL-1的CⅡ乳剂，将混悬乳剂1 mL在大鼠的左后肢足跖皮内皮下给予致炎，7 d后在大鼠尾、背6～8个部位皮下给予0.1 mL该胶原乳剂作为加强免疫，共36只大鼠造模成功。正常对照组等容量相同部位打针0.1 mL生理盐水。将36只造模成功的大鼠随机分为模型对照组、地塞米松组、TMP高剂量组和TMP低剂量组，每组 9只。于造模后第7天至第35天每日给药1次，地塞米松组给予地塞米松打针液2 mg·kg-1肌肉打针，TMP高剂量组肌肉给药TMP 100 mg·kg-1，TMP低剂量组肌肉给药TMP 50 mg·kg-1[7]，正常对照组和模型对照组给予2 mL·kg-1生理盐水肌肉打针。
2.2 CIA大鼠足肿胀度丈量 用足容积测定仪别离于给药前及给药后第7，14，18，22，26，30天测左足体积，核算足肿胀度，公式 =（给药后值-给药前值）/给药前值×100%。
2.3 关节炎指数的改变 从致炎后第7天起开端调查记载，第14天起各组每隔4天进行关节炎指数评分[8]。
2.4 TMP对细胞增殖的影响 造膜35 d后处死大鼠，无菌情况下取下滑膜安排，质量分数为0.2%的Ⅱ型胶原酶消化液参加含体积分数为10%胎牛血清DMEM培育液中，置于37 ℃、体积分数为5%的CO2培育箱中培育消化，传代培育[9]。MTT法检测TMP对细胞增殖的影响：将对数成长期的滑膜细胞以1×105·mL-1的密度接种于96孔细胞培育板，孵育24 h，待细胞贴壁后，别离在各个培育孔中参加不同浓度的TMP 10 μL，以及含体积分数为10% FBS的DMEM培育液90 μL，使各孔的溶液体积为200 μL。持续孵育48 h后，参加四甲基偶氮唑蓝（MTT）溶液（5 mg·mL-1）20 μL，37 ℃持续孵育4 h，弃去上清液，每孔参加DMSO 150 μL，摇床低速振动10 min，用酶标检测仪于490 nm波利益测吸光度OD值（A值）。试验重复3次，记载成果。
2.5 滑膜细胞凋亡检测 依照试剂盒操作进程进行碱性磷酸酶标记法检测细胞凋亡，检测成果判别：在滑膜安排中，细胞舒展，凋亡细胞核呈深蓝色或青紫色，凋亡细胞周围无炎症反响体现，每张切片选取5～10个视界，沿滑膜安排带核算400倍视界中细胞的凋亡数，标出每个视界均匀细胞凋亡数[10]。
2.6 p53表达检测 依照试剂盒操作进程进行免疫组化法p53蛋白表达检测，检测成果判别：p53蛋白表达阳性的滑膜安排细胞核呈橘黄色或棕褐色，每张切片沿滑膜安排带核算400倍视界中阳性细胞的占有率，计数3个视界，标出每个视界均匀阳性细胞占有率，并按阳性细胞占有率分为5级。0，无阳性细胞；+，阳性细胞率0%～25%；++，阳性细胞率 > 25%～50%；+++，阳性细胞率 > 50%～75%；++++，阳性细胞率 > 75%～100%。0级定级积分为0，+积分为1，以此类推[10]。
2.7 统计学办法 选用SPSS 20.0软件进行统计分析。计量材料以标明，选用t查验。以P < 0.05为差异有统计学含义。
3 结 果
3.1 TMP对CIA大鼠足爪肿胀度的影响 与正常对照组比较，模型对照组足爪肿胀度显着添加（P < 0.01）；与模型对照组比较，医治18 d后，TMP高剂量组及地塞米松组比模型对照组大鼠足爪肿胀度峰值下降，差异有统计学含义（P < 0.01）；
TMP低剂量组与模型组大鼠足爪肿胀度比较，差异无统计学含义（P > 0.05）。见表1。
3.2 TMP对CIA大鼠多发性关节炎指数的影响 与正常对照组比较，致炎后第14天开端，模型对照组多发性关节炎指数升高，差异有统计学含义
（P < 0.01）；医治18 d后，TMP高剂量组及地塞米松组比模型对照组多发性关节炎指数下降，差异有统计学含义（P < 0.01）；TMP低剂量组与模型对照组比较，差异无统计学含义（P > 0.05）。见表2。
3.3 TMP对CIA大鼠多发性关节炎滑膜细胞增殖的影响 MTT法研讨显现，与正常对照组比较，模型对照组大鼠滑膜安排增殖显着升高（P < 0.01）；与模型对照组比较，地塞米松组与TMP高剂量组可下降OD值，进步按捺率（P < 0.01）；TMP低剂量组与模型對照组比较，差异无统计学含义（P > 0.05）。见表3。
3.4 TMP对CIA大鼠多发性关节炎滑膜细胞凋亡及p53的影响 碱性磷酸酶标记法和免疫组化法镜下调查滑膜细胞凋亡与p53表达积分显现：与正常对照组比较，模型对照组大鼠滑膜细胞凋亡积分显着下降、p53表达显着增高（P < 0.01）；与模型组比较，TMP高剂量组与地塞米松组大鼠滑膜细胞凋亡积分增高、p53表达下降（P < 0.01）；TMP低剂量组与模型对照组比较，滑膜细胞凋亡积分、p53表达差异无统计学含义（P > 0.05）。见表4。
4 讨 论
RA的病因及发病机制至今尚不清楚，但越来越多的依据标明破骨细胞的过度增殖、滑膜细胞凋亡妨碍等在其发病中起着决定性的效果。RA关节软骨和骨安排的危害首要是因为滑膜细胞的活化和增生引起。滑膜细胞过度增生源于滑膜细胞凋亡的相对缺乏，RA患者滑膜细胞存在细胞凋亡进程的反常，这些反常或许与p53表达失衡及体内其他调理要素（如炎性细胞因子等）有关[11]。
FIRESTEIN等[12]发现，与肿瘤安排类似的p53反常表达在RA软骨腐蚀处的滑膜和培育的RA滑膜细胞存在。p53是一种按捺癌蛋白，它还可供给约束细胞成长和导致细胞凋亡的要害信号，是DNA修正和细胞仿制的重要调理因子[13]。p53经过添加表达修正危害的DNA，如危害严峻不能修正，则细胞凋亡，当p53发作反常表达时细胞凋亡受阻，导致细胞过度增生[14]；p53反常表达或许与RA滑膜安排缓慢炎症致DNA危害有关[15]；在RA病程中，p53反常表达可下降细胞凋亡的才能，促进滑膜细胞增殖，致关节危害[16]。AUPPERLE等[17]研讨也标明，RA滑膜细胞p53蛋白存在反常表达，并证明p53蛋白是滑膜细胞凋亡的重要调理剂。因而，按捺滑膜细胞过度增生、促进其凋亡，有或许成为医治这类疾病的一个有用途径。
TMP是中药川芎的有用成分之一，具有活血化瘀、理气、抗炎、止痛、按捺血小板集合、改进微循环等效果，但其医治RA的详细效果机制尚不非常清晰。本研讨成果显现，TMP（100 mg·kg-1）可显着下降足爪肿胀程度峰值，使关节炎指数下降（P < 0.01），对CIA大鼠的关节炎有显着效果；与模型对照组比较，TMP（100 mg·kg-1）可下降OD值、进步按捺率。碱性磷酸酶标记法和免疫安排化学法成果显现，TMP（100 mg·kg-1）可显着增高细胞凋亡积分、下调p53表达，阐明TMP
（100 mg·kg-1）对CIA大鼠关节炎的医治效果或许与下调p53表达然后促进滑膜细胞凋亡有关。
综上所述，关节滑膜细胞是TMP发挥效果的首要靶细胞之一，对CIA大鼠具有显着的医治效果，其机制或许是经过下降CIA大鼠滑膜细胞p53的表达水平，促进滑膜细胞凋亡，按捺关节滑膜细胞增殖，减轻部分缓慢炎症反响，然后对CIA大鼠发挥医治效果。
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