黄艳峰+李丹帆+陈俊+林秋英+叶锦霞+吴广文
【摘 要】意图：讨论彻骨消痛胶囊对膝骨关节炎大鼠关节软骨G蛋白偶联信号传导体系的影响。办法：2月龄清洁级雄性SD大鼠36只，喂食1周后，随机分为空白组12只和造模组24只。造模组在第1，4，7天双膝关节腔打针0.2 mL质量分数为4%的木瓜蛋白酶。造模成功后，抽签法随机分为模型组和彻骨消痛胶囊组，每组12只。彻骨消痛胶囊组依照3.6 g·kg-1·d-1的剂量灌服彻骨消痛胶囊，空白组、模型组给予等量生理盐水。12周后取关节软骨，选用Western blot技能检测关节软骨中Gαs、Gα（i）、Gα（pan）蛋白表达。成果：与空白組比较，模型组Gαs、Gα（pan）表达量下降，Gα（i）表达量上升，差异有统计学含义（P < 0.01）；与模型组比较，彻骨消痛胶囊组Gαs、Gα（pan）表达量上升，Gα（i）表达量下降，差异有统计学含义（P < 0.01或P < 0.05）。定论：彻骨消痛胶囊或许经过激活G蛋白偶联信号传导体系，推迟关节软骨的退变。
【关键词】 骨关节炎，膝；彻骨消痛胶囊；G蛋白偶联信号传导体系；软骨退变
【ABSTRACT】Objective：To investigate the effect of Tougu Xiaotong Jiaonang（彻骨消痛胶囊）on G protein coupled signal transduction system of articular cartilage in rats with knee osteoarthritis.Methods：Thirty-six two-month male SD rats fed for a week were randomly divided into a blank group（12 rats）and a model group（24 rats）.The model group was injected with 0.2 mL of papain（with mass fraction of 4%）into articular cavities of both knees at the first，fourth，and seventh days.After the the models were established，they were randomly divided into a model group and a Tougu Xiaotong Jiaonang group，twelve rats in each group.The Tougu Xiaotong Jiaonang group was drenched with Tougu Xiaotong Jiaonang（3.6 g·kg-1·d-1），while the control group and the model group were given normal saline.After twelve weeks，the articular cartilage was taken and the expressions of protein Gαs，Gα（i）and Gα（pan）in articular cartilage were detected by Western blot technique.Results：Compared with the control group，the expression of Gαs and Gα（pan）in the model group decreased，while the expression of Gα（i）increased，and the difference was statistically significant（P < 0.01）.Compared with the model group，the expressions of Gαs and Gα（pan）in the Tougu Xiaotong Jiaonang group increased and the expression of Gα（i）decreased，and the difference wasstatistically significant（P < 0.01 or P < 0.05）.Conclusion：Tougu Xiaotong Jiaonang may delay the degeneration of articular cartilage by activating G protein coupled signal transduction system.
【Keywords】 osteoarthritis，knee；Tougu Xiaotong Jiaonang（彻骨消痛胶囊）；G protein coupled signal transduction system；cartilage degeneration
膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是关节软骨退行性改动继发引起的一种缓慢关节疾病[1]。软骨退变是骨关节炎（osteoarthritis，OA）的首要病理改动，而软骨细胞凋亡在软骨退变过程中发挥重要效果[2]，现在尚无特效药及办法阻挠疾病的发展。彻骨消痛胶囊是福建中医药大学隶属第二人民医院院内制剂，能有用改进KOA患者临床症状[3]，维护关节软骨[4-9]，但其效果机制不明。G蛋白偶联信号传导体系是一类重要的细胞跨膜信号传导途径之一，在软骨细胞凋亡中起重要的调控效果，参加软骨退变[10-11]。因而，本研讨从G蛋白偶联信号传导体系讨论彻骨消痛胶囊推迟KOA软骨退变的或许机制。
1 实验材料
1.1 实验动物 36只清洁级2月龄雄性SD大鼠，体质量（200±20）g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司供给，动物合格证号：SCXK（沪）2012-0002。实验动物处理办法参照《关于善待实验动物的辅导性定见》履行。endprint
1.2 实验药物 彻骨消痛胶囊（闽制字Z20100006）由福建中医药大学隶属第二人民医院供给。
1.3 首要试剂 Gαs（K-20）抗体（美国Santa Cruz Biotechnology公司）；Gα（i）、Gα（pan）、β-actin和羊抗兔二抗（美国Cell Signaling Technology公司）；PVDF膜（美国Millipore公司）。
1.4 首要仪器 LX-800酶标仪（美国BioTek公司）；化学发光成像体系（美国Bio-Rad公司）；低温高速离心机（德国eppendorf公司）。
2 方 法
2.1 分组与模型制备 36只雄性SD大鼠，喂食1周后，随机分为空白组12只和造模组24只。空白组不做任何处理。造模组在第1，4，7天双膝关节腔打针0.2 mL质量分数为4%的木瓜蛋白酶[4]。
术后2周拍照膝关节DR片进行模型判定。判定成功后，按随机数字表法将造模组24只随机分为模型组和彻骨消痛胶囊组（TGXTC组），每组12只。
依据人和动物药物临床等效剂量换算[12]，TGXTC组按3.6 g·kg-1·d-1的剂量灌胃彻骨消痛胶囊，空白组、模型组给予等量生理盐水灌胃。造模组和TGXTC组实验过程中各掉落1只。
2.2 选材与处理 接连灌胃12周后，取双膝关节软骨，敏捷放入液氮中保存，用于后期相关目标检测。
2.3 Western blot检测G蛋白偶联信号传导体系Gαs、Gα（i）、Gα（pan）蛋白表达 将膝关节软骨置于高温消毒后的研钵中，参加液氮敏捷研磨，之后按1 g∶3 mL份额参加蛋白裂解液，提取蛋白。之后依照4∶1份额参加5×蛋白上样缓冲液，100 ℃变性10 min，保存蛋白。依据BCA蛋白定量成果，每孔按40 μg蛋白进行上样，经质量分数为12%的SDS-PAGE凝膠电泳分离，选用半干转的办法将蛋白从凝胶转移到PVDF膜上，PVDF膜上参加体积分数为5%的脱脂奶粉，室温关闭2 h，4 ℃分别加抗体Gαs（1∶500）、Gα（i）（1∶1000）、Gα（pan）（1∶1000）、β-actin（1∶1000）过夜，次日室温下二抗孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min，滴加200 μL ECL化学发光剂，曝光显影。Bio-Rad Image Lab图画处理软件，剖析意图蛋白和内参β-actin条带灰度值，核算蛋白相对表达量。
2.4 统计学办法 选用SPSS 22.0软件进行统计剖析。契合正态分布的计量材料以表明，2组间比较选用t查验，多组数据之间比较选用单要素方差剖析（One-Way ANOVA）；不契合正态分布的计量材料选用秩和查验。一切查验均选用双侧查验。以P < 0.05为差异有统计学含义。
3 结 果
3.1 KOA模型判定成果 空白组关节空隙正常、关节面平坦、关节边际可见润滑锋利的线样细密影，软骨下骨密度均匀。模型组关节空隙显着变窄、关节面不平坦，软骨损坏区边际骨质增生、硬化，关节边际骨赘构成。见图1。
3.2 彻骨消痛胶囊对Gαs、Gα（i）、Gα（pan）蛋白表达的影响 与空白组比较，模型组Gαs、Gα（pan）的表达量下降，Gα（i）的表达量上升，差异有统计学含义（P < 0.01）；与模型组比较，TGXTC组医治12周后，Gαs、Gα（pan）的表达量上升，Gα（i）的表达量下降，差异有统计学含义（P < 0.05或P < 0.01）。见图2。
4 讨 论
KOA属中医学“痹证”领域。其病理特色为“本虚标实，本痿标痹”，首要病因病机为肝肾亏虚，气血缺乏，寒瘀阻滞[13]。肝肾亏虚是OA病变的底子，与神经-内分泌-免疫网络功用紊乱密切相关[14]。中医肝肾功用集中反映下丘脑-垂体-靶腺轴的功用，反映这几个轴功用下降的目标是肝肾亏虚较为特异的目标，而G蛋白偶联信号传导体系是下丘脑-垂体-靶腺轴的重要履行者[15]。
G蛋白偶联信号传导体系首要由激动型G蛋白（Gs）、按捺型G蛋白（Gi）和磷脂酶C型G蛋白（Gp）组成，不同的G蛋白能特异地将受体和与之相应的效应酶偶联，活化相应酶和离子通道，发生重要的第二信使，然后介导软骨细胞线粒体凋亡信号转导通路，参加软骨退变[10-11]。此外，线粒体是真核细胞内重要的细胞器，在生理情况下，为细胞供给能量；在病理情况下，线粒体结构功用的改动在细胞凋亡过程中发挥重要的调控效果，经过Bcl-2宗族蛋白中促凋亡与抗凋亡蛋白之间的相互效果操控线粒体外膜通透性，在细胞表里很多凋亡影响要素下，促进多种促细胞凋亡因子从线粒体表里膜空隙释放到胞质，激活Caspase-9；Caspase-9再激活Caspase-3，然后发动细胞的凋亡程序[16-17]。而软骨细胞是关节软骨中仅有的细胞，软骨细胞的增殖、分解、凋亡在OA的病理进程中发挥重要效果。因而，有用调控G蛋白偶联信号传导体系，按捺软骨细胞凋亡，或许是防治OA的一个有用途径。
彻骨消痛胶囊由巴戟天、白芍、肿节风、川芎组成。方中巴戟天温阳补肾为君药，白芍养血柔肝为臣药，川芎活血行血、肿节风祛风除湿为佐使药，共奏补肾柔肝、活血祛风之功。正是以中医“肾主骨”“肝主筋”理论为辅导，针对KOA病机组方。前期研讨发现，该方可多层面、多途径、多靶点医治KOA，经过调控信号传导通路，调理机体的免疫应对以及细胞的增殖、分解及凋亡[18]。
KOA动物模型是研讨OA发病机制的重要手法。前期研讨发现，关节内打针质量分数为4%的木瓜蛋白酶可成功仿制KOA动物模型[19-22]。本研讨中，造模组大鼠在第1，4，7天双膝关节腔打针0.2 mL质量分数为4%的木瓜蛋白酶，2周后，拍照膝关节DR片，成果发现，空白组关节空隙正常，关节面平坦，软骨下骨密度均匀。而造模组则出现关节空隙显着变窄，关节面不平坦，关节边际骨赘构成等KOA病理学改动，进一步证明打针质量分数为4%的木瓜蛋白酶仿制KOA模型的可行性，也为后期的研讨奠定根底。别的，本次研讨发现，彻骨消痛胶囊能够升高Gαs、Gα（pan）蛋白的表达水平，下降Gα（i）蛋白的表达水平，提示彻骨消痛胶囊或许经过激活G蛋白偶联信号传导通路，按捺细胞凋亡，终究推迟KOA软骨退变。可是，因为引起KOA的要素较多，且彻骨消痛胶囊组分多且杂乱，具体效果机制有待后期进一步深入研讨。endprint
5 参考文献
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收稿日期：2017-09-20；修回日期：2017-10-27endprint
