刘伯龄+陈齐勇+付长龙+刘少强+叶小伟+梁清+叶锦霞+李西海
【摘 要】意图：從Wnt/β-catenin信号通路讨论独活寄生汤水提物对大鼠椎间盘退变软骨细胞功用的影响。办法：①用水提加热回流法制备独活寄生汤水提物成分；②选取4周龄健康雄性SD大鼠30只，选用机械-酶消化法别离大鼠椎间盘软骨安排，树立软骨细胞体外培育体系并进行判定；③RT-PCR、Western blot法别离检测经DKK-1按捺剂干涉及（或）经白细胞介素-1β诱导的椎间盘软骨细胞Wnt4、GSK-3β、β-catenin mRNA与蛋白含量的表达。成果：①椎间盘软骨细胞经Ⅱ型胶原法染色后，阳性对照组胞浆区域浸染为棕黄色；②RT-PCR、Western blot检测成果示，与正常组比较，模型组Wnt4、GSK-3β、
β-catenin mRNA与蛋白含量表达显着升高（P < 0.01）；与模型组比较，独活寄生汤水提物组（100，200，400 μg·mL-1）的Wnt4、GSK-3β、β-catenin mRNA与蛋白含量表达显着下降（P < 0.01或P < 0.05），其间以200 μg·mL-1组的表达量最低（P < 0.01）。定论：独活寄生汤水提物组可经过调控Wnt/β-catenin信号通路，下调大鼠椎间盘退变关节软骨中Wnt4、GSK-3β、β-catenin mRNA与蛋白含量表达，然后推迟椎间盘软骨细胞退变。
【关键词】 椎间盘退变性疾病；椎间盘软骨细胞；独活寄生汤；Wnt/β-catenin信号通路；大鼠
Effect of Duhuo Jisheng Tang（独活寄生汤）on the Regulation of Rat Intervertebral Disc Chondrocyte Wnt/β-catenin Signaling Pathway
LIU Bo-ling，CHEN Qi-yong，FU Chang-long，LIU Shao-qiang，YE Xiao-wei，LIANG Gui-qing，YE Jin-xia，LI Xi-hai
【ABSTRACT】Objective：To investigate the effect of Duhuo Jisheng Tang（独活寄生汤）water extract on the regulation of rat intervertebral disc chondrocyte Wnt/β-catenin signaling pathway.Methods：①Duhuo Jisheng Tang water extract was made by the water extraction and reflux method.②A total of thirty four-week-old healthy male SD rats used to isolate intervertebral disc cartilage tissue by mechanical enzymatic digestion method to establish in vitro culture system of chondrocytes for identification.③RT-PCR，Western blot were used to detect the expression of contents of Wnt4，GSK-3β and β-catenin mRNA intervened by DKK-1
inhibitor and induced by interleukin -1β.Results：①After typeⅡcollagen staining，the cytoplasmic domain of the intervertebral disc cartilage cells in the positive control group was disseminated yellowish brown.②RT-PCR and Western blot detect results showed that compared with the normal group，the expression of contents of Wnt4，GSK-3β，
β-catenin mRNA and protein increased significantly in the model group（P < 0.01）.Compared with the model group，the expression of contents of Wnt4，GSK-3β，β-catenin mRNA and protein in the Duhuo Jisheng group（100，200，400 μg·mL-1）decreased significantly（P < 0.01 or P < 0.05），
among which the content expression in the group of 200 μg·mL-1 was the lowest（P < 0.01）.Conclusion：Duhuo Jisheng Tang water extract can delay the cartilage cell degeneration of intervertebral disc by regulating Wnt/β-catenin signaling pathway and down-regulating the content expression of Wnt4，GSK-3β，β-catenin mRNA and protein in degenerated articular cartilage of rat intervertebral disc.endprint
【Keywords】 degenerative disc disease；intervertebral disc chondrocyte；Duhuo Jisheng Tang（独活寄生汤）；
Wnt/β-catenin signaling pathway；rats
椎间盘退变性疾病（如腰椎间盘突出症）的底子病理变化是椎间盘退变，其间软骨终板作为椎间盘的重要组成部分，在保持椎间盘正常功用方面发挥重要效果。近年来，软骨终板退变作为椎间盘退变的始动要素成为新的热门[1-2]。研讨证明，椎间盘退变关键要素之一是椎间盘软骨细胞功用偶联失衡，导致持续病理发作，凋亡与细胞分解反常，进而诱导软骨塑形重建，椎体骨赘构成[3]。现在对椎间盘退变规则的研讨较为滞后，切当的发病机制和发展进程仍有待进一步讨论，临床往往采纳被迫的、对症式的医治办法，在这些医治中，中医药是有用、安全、不良反响少的常用办法，但迫切需求持续深化其防备和医治机制的研讨。
Wnt信号转导途径调理操控着许多生命进程，包含生物体的成长、发育、疾病、变老与逝世等；也包含细胞形状与功用的分解与保持、免疫、应激、细胞癌变与细胞凋亡等[4]。在脊椎动物骨骼体系发作进程中，Wnt宗族的各成员在骨与软骨发育进程中具有重要调理效果，其间Dickkof族（DKK-1）
作为该信号通路的按捺剂，可按捺Wnt与膜受体的结合，进而阻断该信号通路[5-8]。
独活寄生汤出自唐·孙思邈《备急千金要方》，由独活9 g，桑寄生、杜仲、茯苓、肉桂心、细辛、防风、川芎、牛膝、当归、人参、秦艽、白芍、熟地黄、甘草各6 g组成，具有祛风湿、止痹痛、益肝肾、补气血之成效[9]。诸药合用，使外邪得除，肝肾得补，气血得充，邪正统筹，祛邪不伤正，扶正不留瘀，发挥“从本治痿，从标治痹”效果，切中椎间盘退变性疾病的病因病机。该方长时间用于临床，医治椎间盘退变性疾病有较好效果[10-11]。前期试验研讨标明其能推迟软骨退变[12-13]，但效果机制有待进一步研讨。因而，本文从Wnt/β-catenin信号通路讨论独活寄生汤水提物调控对大鼠椎间盘退变软骨细胞功用的影响，有意图地调控其功用，对推迟软骨终板以及椎间盘退变有着重要的根底与运用价值。
1 试验材料
1.1 试验动物 SPF级健康SD雄性大鼠30只，体质量90～100 g，由福建中医药大学试验动物中心供给，试验动物许可证号：SCXK2014-0001（闽）。
1.2 试验药物及首要试剂 独活寄生汤（福建中医药大学隶属第三人民医院）；磷酸盐缓冲液、DMEM/LOW GLUCOSE（HyClone）；TRIZOL（美国life）；异丙醇、无水乙醇（国药集团）；琼脂糖（Biowest Agarose）；核酸染料（Solarbio）；逆转录试剂盒、DNA Marker Ⅱ（北京全式金生物技术有限公司）；WB玻板（美国BIO-RAD）；PMSF（蛋白酶按捺剂）、RISF（裂解液）、蛋白上样缓冲液（Thermo）；30%聚丙烯酰胺、Tris（pH = 8.8与pH = 6.8）、SDS（十二烷基磺酸钠）、10×电泳液、AP（过硫酸铵）、TEMED、50×TAE（碧云天生物有限公司）；10×TBST（Solarbio）；高效关闭液（康为世纪）；Wnt4、GSK-3β、β-catenin、GAPDH引物（上海生工）；一抗（兔抗）Wnt4、GSK-3β、β-catenin、β-actin（美國Abcam公司）；二抗（羊抗兔）（美国CST公司）；1-StepTMTransfer Buffer、ECL高效显影液（美国Thermo）等。
1.3 首要仪器 DNA扩增仪（9600型，美国PE）；低温高速离心机（64R型，美国BECKMAN）；超纯水设备（MILLI-Q型，美国MILIPORE）；荧光倒置相差显微镜（Olympus，日本TKO）；无菌操作台（AIRTECH型，姑苏安泰）；超净工作台（SW-CJ-1F型，姑苏安泰）；凝胶成像体系（GELDOC2000型，美国BIO-RAD）；全自动酶标仪（BIO-TEK ELX800型，美国BIO-Tek）；CO2恒温培育箱（BB16/BB5060型，德国Heraus）等。
2 试验办法
2.1 独活寄生汤水提物的提取 称取独活9 g，桑寄生、杜仲、茯苓、肉桂心、细辛、防风、川芎、牛膝、当归、人参、秦艽、白芍、熟地黄、甘草各6 g，水回流提取2次，每次2 h，兼并提取液，抽滤，浓缩成浸膏，60 ℃水浴蒸干至恒重，待经低温下研磨成粉末状，精确称量浸膏50 mg，参加质量分数为5%的FBS培育基5 mL溶解，超声10 min，再经0.22 μL无菌滤嘴过滤后，4 ℃冰箱保存备用，配成10 mg·mL-1独活寄生汤水提物母液，备用。
2.2 软骨细胞的别离、培育与判定 质量分数为10%的水合氯醛麻醉下脱颈椎处死SD大鼠（每次5只），别离颈、腰椎椎间盘软骨终板，搜集后经剪碎至每单位体积1 mm3，PBS缓冲液冲刷至少
3次后移至无菌小培育皿中，按每皿2.5 mL参加质量分数为0.2%的Ⅱ型胶原酶进行消化，
15 mL离心管搜集消化后的上清液（2 h 1次），
1500 r·min-1离心机离心5 min后弃上清液，移液器代液（含质量分数为10%的胎牛血清DMEM）状况缓慢吹匀沉积，经计数板计数（2×105·mL-1）
后栽培原代软骨细胞于培育瓶进行培育，经48 h后初度换液，镜下调查细胞铺满80%瓶底面积时，经胰酶消化进行细胞传代，本试验运用第2代软骨细胞。
Ⅱ型胶原免疫安排化学染色：软骨细胞（经计数每毫升2500个）待爬片后，经PBS冲刷3次，
质量分数为4%的多聚甲醛固定30 min，再经冲刷、裂解（0.1%破膜剂50 μL）20 min，冲刷后参加endprint
50 μL质量分数为3%的H2O2反响20 min，再次冲刷后经质量分数为5%的BSA关闭30 min，阳性对照组参加含Ⅱ型胶原1∶200的一抗反响过夜，阴性对照组参加PBS作为对照，后经PBS冲刷3遍
后参加50 μL二抗（1∶200）反响30 min，再次冲刷后以每张玻片50 μL DAB滋润10 min，再顺次经过漂洗、苏木素复染、冲刷（PBS）、返蓝2 s、常温晒干、梯度酒精、二甲苯进行脱水与通明后封片与调查[6]。
2.3 试验分组 本试验运用第2代软骨细胞，经判定后共分6组，别离为正常组，模型组，DKK-1按捺剂组，以及独活寄生汤水提物低、中、高剂量组。除正常组外，其他各组均经10 ng·mL-1浓度IL-1β造模，造模成功后，DKK-1按捺剂组参加
5 μg·mL-1浓度的DKK-1，独活寄生汤水提物低、中、高剂量组别离参加100，200，400 μg·mL-1的独活寄生汤水提物。
2.4 RT-PCR法检测Wnt4、GSK-3β、β-catenin mRNA
2.4.1 Wnt4、GSK-3β、β-catenin mRNA引物规划与组成
2.4.2 RT-PCR办法 选用Trizol法进行Total RNA提取，并运用核酸蛋白检测仪进行浓度检测；逆转录后进行PCR，顺次运用移液枪精确参加Mix 10 μL、上游引物1 μL、下流引物1 μL、DEPC水7 μL、cDNA 1 μL制造公共管，即每管20 μL。PCR为94 ℃ 4 min条件下首要进行预变性，循环35次（94 ℃ 30 s、退火58 ℃ 30 s、72 ℃
45 s），后置于72 ℃ 10 min，并于4 ℃保存；制备1.5%琼脂糖凝胶，上样后，在100 V、70 mA、15 min条件下电泳，运用BIO-RAD Fluor-S TM MultiImager图画剖析仪下扫描，经剖析后摄影存档。
2.5 Western blot检测软骨细胞Wnt4、GSK-3β、β-catenin表达 独活寄生汤水提物（100，200，400 μg·mL-1）干涉48 h后，提取各组软骨细胞总蛋白，并进行BCA蛋白定量；顺次制造12%别离胶和5%浓缩胶并进行灌板，快速刺进梳子，扫除气泡后，置于室温下凝结；上样后进行电泳，选用半干式进行转膜，转膜结束后，敏捷取出膜并符号蛋白面，后将其置于TBST中漂洗2遍。脱脂牛奶关闭2 h后洗膜，再将各条膜放入预先装备好的β-actin（1∶1000）、Wnt4（1 μg·mL-1）、GSK-3β（1∶5000）、β-catenin（1∶4000）的一抗中4 ℃冰箱摇床震动过夜，漂洗3次（每次
10 min）后置于二抗（1∶5000）关闭袋中室温反响1 h，再次漂洗3次（每次10 min），最终制造ECL发光液进行显影，在凝胶成像仪下曝光成像并剖析贮存。
2.6 统计学办法 选用SPSS 19.0软件进行统计剖析。计量材料以表明，2组间比较契合正态散布选用t查验，3组及以上组间比较选用单要素方差剖析。以P < 0.05为差异有统计学含义。
3 结 果
3.1 软骨细胞调查与判定 本试验第2代大鼠椎间盘软骨细胞镜下调查：散布均匀，鸿沟明晰，形状结构共同，呈显着的铺路石状外观；經Ⅱ型胶原法染色后，阳性对照组胞浆区为棕黄色，阴性对照组胞浆区色彩通明，以上可判定本试验所用细胞为椎间盘软骨细胞。见图1。
3.2 RT-PCR检测成果 RT-PCR检测成果显现，独活寄生汤水提物（100，200，400 μg·mL-1）效果于经IL-1β诱导退变的椎间盘软骨细胞后，可下调Wnt4、GSK-3β、β-catenin mRNA含量表达。与正常组比较，模型组Wnt4、GSK-3β、β-catenin mRNA含量均显着升高，差异有统计学含义（P < 0.01），
提示椎间盘软骨细胞在必定程度上发作退变，退变模型树立；而预参加DKK-1按捺剂组的Wnt4、GSK-3β、β-catenin mRNA含量显着低于模型组
（P < 0.01），提示预参加DKK-1按捺剂可在必定程度上按捺椎间盘软骨细胞Wnt/β-catenin信号通路；在Wnt4、GSK-3β、β-catenin mRNA指标上，与模型组比较，独活寄生汤水提物组（100，200，400 μg·mL-1）的mRNA含量均显着下降，特别以200 μg·mL-1组的表达量最低（P < 0.01），提示独活寄生汤水提物可经过调控Wnt4、GSK-3β、β-catenin mRNA表达，在必定程度经过调控Wnt/β-catenin途径，进而推迟大鼠椎间盘软骨细胞的退变进程。见图2。
3.3 Western blot检测成果 Western blot检测成果显
示，独活寄生汤水提物（100，200，400 μg·mL-1）
效果于经IL-1β诱导退变的椎间盘软骨细胞后，可下调软骨细胞内Wnt4、GSK-3β、β-catenin蛋白含量表达。与正常组比较，模型组Wnt4、GSK-3β、
β-catenin含量均显着升高，差异有统计学含义（P < 0.01），提示软骨细胞在必定程度上发作退变，退变模型树立；而预参加DKK-1按捺剂组的Wnt4、GSK-3β、β-catenin蛋白含量显着低于模型组（P < 0.01）；在Wnt4、GSK-3β、β-catenin指标上，与模型组比较，独活寄生汤水提物组（100，200，400 μg·mL-1）的蛋白含量均显着下降，特别以200 μg·mL-1组的表达量最低（P < 0.01），提示独活寄生汤水提物可经过调控Wnt4、GSK-3β、β-catenin表达，在必定程度上调控Wnt /β-catenin途径，进而推迟大鼠椎间盘软骨细胞的退变进程。见图3。endprint
4 讨 论
Wnt/β-catenin信号途径与软骨细胞的退变具有密切联系[14-15]，其是否也在椎间盘软骨细胞退变进程中发挥重要的调控效果是咱们重视的焦点。因而，本研讨经过体外培育大鼠椎间盘软骨细胞，并经Ⅱ型胶原法染色进行判定。鉴于IL-1β可按捺软骨细胞活性，并下调蛋白聚糖和Ⅱ型胶原基因表达，一起亦可诱导细胞外基质蛋白酶、炎症因子和NO产品发生[16-17]，因而本试验运用10 ng·mL-1浓度IL-1β干涉椎间盘软骨细胞。成果发现，与正常组比较，模型组在Wnt4、GSK-3β、β-catenin mRNA与蛋白含量均显着升高（P < 0.05），因而，IL-1β可作为一种刻画大鼠椎间盘软骨细胞退变模型的方法。Dickkof族（DKK-1）可经过直接削减可利用的辅佐受体LRP的数量按捺Wnt与膜受体的结合而发挥效果，常被作为Wnt/β-catenin信号通路的按捺剂，因而本试验选用5 μg·mL-1浓度的DKK-1影响Wnt/β-catenin信号通路[18-20]，成果发现，5 μg·mL-1浓度的DKK-1可按捺经IL-1β诱导大鼠椎间盘软骨细胞中Wnt4、GSK-3β、β-catenin mRNA与蛋白含量表达。
前期研讨发现，独活寄生汤水提物200 μg·mL-1
可显着促进正常软骨细胞内Cyclin D1、CDK4、CDK6及P21 mRNA的表达[21]，故本试验在前期根底上，以Wnt/β-catenin信号通路为基点，讨论独活寄生汤水提物（100，200，400 μg·mL-1）调控IL-1β诱导的大鼠椎间盘退变软骨细胞功用的影响，成果显现，独活寄生汤水提物（100，200，400 μg·mL-1）干涉IL-1β诱导的大鼠椎间盘退变软骨细胞48 h后，可显着下调Wnt4、
GSK-3β、β-catenin mRNA与蛋白含量表达，其间以200 μg·mL-1组的表达最为显着（P < 0.01），这也与前期研讨相切合，提示独活寄生汤水提物可经过影响Wnt/β-catenin途径，进而调控Wnt4、GSK-3β、β-catenin表达，在必定程度上推迟大鼠椎间盘软骨细胞的退变进程。
本试验研讨的要点在于独活寄生汤水提物对体外培育的大鼠椎间盘软骨细胞影响，其药理药效效果是否亦可经过体内代谢而对椎间盘发挥影响，仍需求进一步经过很多动物试验进行验证。
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收稿日期：2017-08-20；修回日期：2017-09-28endprint
