张振国 贾丽燕 杨廷舰
【摘要】意图 调查按捺PI3K/Akt信号通路对胶质瘤侵袭性及增殖力的影响。办法 制备对数成长期的胶质瘤细胞，设置对照组和试验组，空白对照组不进行药物处理，一般对照组通过药物顺铂（DDP）处理，试验组通过磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）按捺剂LY294002（浓度别离调整为
10 umol/L、20 umol/L、40 umol/L）处理。Transwell试验、MTT法别离检测LY294002对胶质瘤侵袭性及增殖力的影响。成果 Transwell试验标明DDP组的侵袭性弱于空白对照组，试验组（LY294002 10 umol/L）
的侵袭性显着弱于DDP组（P<0.05）；MTT法检测标明DDP组细胞相对增殖率小于空白对照组，经LY294002（10 umol/L）处理的试验组相对增殖率显着小于DDP组，差异有统计学含义（P<0.05）。
定论 按捺PI3K/Akt信号通路能够削弱胶质瘤的侵袭性及增殖力，为胶质瘤的分子靶向性医治带来协助。
【要害词】PI3K/Akt；LY294002；神经胶质瘤；侵袭性；细胞增殖
【中图分类号】R739.41 【文献标识码】B 【文章编号】ISSN.2095-6681.2018.07..03
胶质瘤是最多见的一类脑肿瘤，呈侵袭性成长，病况发展常常累及周围脑安排，所以单纯依托手术切除无法治好，5年存活率约为25%～35%[1，2]，一起胶质瘤细胞反抗射线辐射才能强，所以放射疗法关于患者的预后含义不大[3]。跟着在分子生物学范畴的研讨深化，靶向医治胶质瘤具有重大含义，能够对肿瘤进行选择性杀伤[4]。多种因子一起参加致使胶质瘤具有成长侵袭性，其间PI3K/Akt通路激活具有要害性作用[5，6]，其能够参加细胞下流信号的激活，调理细胞的搬运、增殖和代谢等 [7]，因而通过研制特异性分子按捺剂对医治胶质瘤含义深远。本试验以LY294002按捺PI3K/Akt通路活性，探求胶质瘤侵袭性及增殖力的改变，现对试验相关信息报导如下。
1 材料与办法
1.1 细胞培育
（1）冻结：购自上海中科院生物学细胞库的胶质瘤HS683细胞1瓶（1×106 cells/瓶），在37℃的温水中快速将其溶解；（2）脱壁：适量预温（37℃）的PBS缓冲液润洗细胞3次，1 min/次；（3）消化：参加适量0.25%胰蛋白酶溶液，在二氧化碳培育箱（37℃、5% CO2）内消化2分钟；（4）停止消化：倒置显微镜下调查可见细胞形状缩短变圆并掉落至瓶底，参加6 ml DMEM培育基（含10%胎牛血清）当即停止消化；（5）细胞悬液：无菌吸管由下向上重复悄悄吹打，使其涣散离团制成单个细胞悬液；（6）搬运细胞至EP管中调整密度为104/200 μl，并参加0.4%的台盼蓝染色。
1.2 办法
1.2.1 MTT法
（1）微量移液器接种200 μl细胞悬液至96孔细胞板，培育箱（37℃、5% CO2）中孵育24小时；（2）把EP管做好符号并参加适量的无血清培育基，从高到低稀释药物浓度，别离向管中参加等量浓度为10 umol/L、20 umol/L、40 umol/L的LY294002，以及浓度为2.5 ug/ml的顺铂，充沛混匀，空白对照组不进行药物处理；（3）以每种药物、不同浓度重复3个复孔，别离向细胞板孔中参加200 μl无血清培育基，继续培育6小时；（4）细胞孔内参加20 ml浓度为5 mg/ml的MTT溶液（避光），作用4小時，弃去上清液并参加150 μl的DMSO溶液，蓝色结晶溶解后运用酶标仪进行检测。
1.2.2 Transwell侵袭试验
（1）将冰存的Matrigel置于-4℃的冰上过夜，用冰预冷的无血清培育基依照1：6稀释Matrigel至浓度为300 ul/ml，取100 ul稀释的Matrigel参加上室，均匀涂改在孔径为8 um的碳酸酯膜外表，室温放置3小时，使其聚组成凝胶；（2）向上室参加100 ul细胞悬液，并别离参加100 μl含有不同药物、不同浓度的培育基，下室参加400 ul含趋化因子的无血清培育基；（3）放入培育箱中培育24小时，无菌棉签拭去上室碳酸酯膜外表残存的细胞，PBS缓冲液润洗2次，1min/次；（4）3%甲醛溶液固定10 min，台盼蓝染色3分钟，低倍显微镜下进行调查，计数随机5个视界内的细胞平均数。
1.3 统计学办法
选用SPSS 13.0软件进行剖析，计量材料以“x±s”标明，行t查验，计数资以例数（n），百分数（%）标明，行x2查验；以P<0.05为差异有统计学含义。
2 结 果
2.1 两组侵袭细胞数比较
与空白对照组比较，DDP对照组胶质瘤细胞的侵袭性削弱（P>0.05），差异无统计学含义（见表1）。
2.3 三组侵袭细胞数比较
与空白对照组、DDP对照组比较，试验组（LY294002 10 umol/L）胶质瘤细胞的侵袭性显着削弱，差异有统计学含义（P<0.05）。见表2。
2.4 三组侵袭细胞数比较
与试验组（LY294002 10 umol/L）比较，试验组（LY294002 20 umol/L、40 umol/L）胶质瘤细胞的侵袭性削弱，差异无统计学含义（P>0.05）。
2.5 两组细胞相对增殖率比
与空白对照组、DDP对照组比较，试验组（LY294002 10 μmol/L）细胞的相对增殖率显着下降，10 μmol/L、
20 μmol/L、40 μmol/L的LY294002能够使细胞相对增殖率从86.4%降至58.3%、37.9%、20.0%。见图1。
3 讨 论
胶质瘤是恶性程度很高的原发性脑肿瘤，在整个中枢神经系统肿瘤中发病率约占36%～61%[8]。一起肿瘤的临床表现方法也是多种多样，其间以占位效应最为杰出，系于不断增大的瘤体以及水肿程度加重的周围脑安排对正常脑安排的压榨所造成的，颅内压增高一般会有三种常见的症状，比如：头痛（最多见）、吐逆（喷发性）、视物不清等[9]。除此之外，还有部分恶性程度很高的胶质瘤往往发作发展迅速，可在短时间内压榨正常脑安排并使之移位，有发作脑疝的危险[10]。虽然现在针对胶质瘤医治的手术及化疗药物都不断得到改进，但作用一般，其间位生存期只要1年左右[11]。患者承受惯例手术医治后简单再次复发的一个重要原因就是胶质瘤不断侵袭转染周围正常脑安排[12]，一起射线只能不同程度的杀死恶变细胞，所以作用不抱负。
跟着在分子生物学范畴不断获得新的突破性发展，已有研讨标明，激活的PI3K/Akt信号通路具有很强的影响肿瘤成长侵袭的作用。胶质瘤发作演化的前期阶段，阅历的首要分子事情即为表皮因子成长受体（EGFR）因为遭到多种要素诱导发作的基因突变以及蛋白的过度表达[13]。EGFR与其相应的胞内或膜上配体结合能够激活本身，或因为体内EGFR受环境影响发作基因突变然后导致其处于继续的活化不衰减状况，这样会把酪氨酸不断活化使之在细胞内继续表现为磷酸化方法[14]。EGFR能够通过多种方法调控细胞的成长代谢途径，导致肿瘤细胞在体内过度增殖[15]，最要害的途径就是通过PI3K添加此信号通路的活性。PI3K作为细胞膜上的第二信使，能够调理多种活性蛋白的表达，发挥调理细胞成长、搬迁、代谢等的生理学作用，这极大地提高了胶质瘤的侵袭性及增殖力[16]，因而通过特异性分子按捺剂削弱PI3K/Akt信号通路能够为广阔胶质瘤患者带来一丝曙光，为临床医生供给更有用的医治计划[17]。
已有研讨证明，肺癌、胃癌、胰腺癌、结肠癌等恶性肿瘤患者通过运用LY294002能够显着提高化作用果，对改进患者预后有很大的协助，但在胶质瘤医治作用方面的报导仍很稀有，咱们的数据标明按捺PI3K/Akt通路在下降肿瘤侵袭才能方面有着活跃的作用；有研讨发现，化疗药物顺铂联合LY294002运用组胶质瘤细胞的搬迁及增殖力较单纯运用顺铂组削弱，差异有统计学含义，按捺浓度俞大按捺效应愈显着，但成果尚差异无统计学含义；李洋等人研讨发现与对照组、DMSO组比较，通过LY294002处理的胶质瘤细胞增殖力显着下降（10 μmol/L LY294002组相对存活率为55%，20 μmol/L组为30%），试验一起标明，LY294002组胶质瘤的侵袭才能显着下降（52±4）%，差异显着。该试验相同发现，DDP组相较于空白组细胞的成长侵袭性也有不同程度的削弱，但成果差异尚无统计学含义，与空白对照组和DDP组比较，试验组（LY294002 10 μmol/L）细胞的成长侵袭性遭到非常大程度按捺，差異有统计学含义。本试验同之前报导过的相关试验比较长处在于，研讨相同也标明，跟着按捺剂浓度的增大
（10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L LY294002），细胞的侵袭性以及增殖力会愈加削弱，可是，按捺剂的不同浓度对胶质瘤的按捺效应，差异无统计学含义，仍需进行下一步讨论研讨。
跟着在医学分子生物学范畴不断获得新的发展，未来科研的要点应放在加速针对此信号通路按捺药物的研制，这些分子靶向性药物有望在胶质瘤的医治中发挥更有用的作用，以期获得令人更满足的临床作用。
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本文修改：吴宏艳
