邵翔++陈后煌++陈达++马玉环++郑文伟++叶蕻芝++李西海
【摘 要】意图：讨论颞下颌关节发育的分子生物学机制。办法：选取5只BAL B/C重生乳鼠，取头，惯例固定、脱钙、脱水、包埋，选用免疫安排化学技能检测颞下颌关节CollagenⅡ（ColⅡ）、CollagenⅠ（ColⅠ）、Aggrecan和印度豪猪蛋白（Ihh）的表达。成果：颞下颌关节盘中，ColⅠ和ColⅡ表达阳性，Ihh表达强阳性，Aggrecan未见显着表达；髁状突软骨中，ColⅡ表达阳性，Aggrecan表达强阳性，Ihh和ColⅠ少数表达。定论：ColⅡ、ColⅠ、Aggrecan和Ihh正常表达，在颞下颌关节构成与发育进程中发挥重要的效果。
【关键词】 颞下颌关节；软骨基质；免疫安排化学技能；印度豪猪蛋白；小鼠
Experimental Study on the Temporomandibular Joint Cartilage Matrix and the Expression of Ihh in Newborn Rats by Immunohistochemical Technique
SHAO Xiang，CHEN Hou-huang，CHEN Da，MA Yu-huan，ZHENG Wen-wei，YE Hong-zhi，LI Xi-hai
【ABSTRACT】Objective：To investigate the molecular mechanism of the development of temporomandibular
joint.Methods：Heads of five BAL B/C newlyborn rats were taken，fixed，decalcified，dehydrated and embedded.Immunohistochemical technique was used to detect the expressions of CollagenⅡ（ColⅡ），CollagenⅠ
（ColⅠ），Aggrecan and Ihh.Results：In the temporomandibular joint disk，the expressions of ColⅠ and ColⅡ
were positive，the expression of Ihh was strongly positive and Aggrecan had no obvious expression；while in condylar cartilage，the expression of ColⅡ was positive，the expression of Aggrecan was strongly positive，and Ihh and ColⅠ had a little expression.Conclusion：ColⅡ，ColⅠ，Aggrecan and Ihh have normal expressions，playing an important role in the formation and development of the temporomandibular joint.
【Keywords】 temporomandibular joint；cartilage matrix；Immunohistochemical technique；Ihh；mouse
颞下颌关节（temporomandibular joint，TMJ）由下颌骨的下颌头关节面、颞骨的下颌窝和关节结节关节面、关节囊、关节腔，以及将关节腔分为上、下两部分的关节盘组成[1]，多种要素参加影响颞下颌关节的成长发育[2-3]，了解颞下颌关节的成长发育进程，对深入研讨颌面部变形的发病机制有着重要的临床意义。小鼠的颞下颌关节根本结构与人类似，但下颌骨升支端有髁状突、喙突与角突，其间只要髁状突参加构成颞下颌关节。现在，颞下颌关节的结构和功用已有体系的描绘，但其发育相关的分子生物学机制有待深入研讨[4-5]。因而，本研讨以重生乳鼠颞下颌关节为研讨目标，选用免疫安排化学技能，调查小鼠发育进程中颞下颌关节软骨基质与印度豪猪蛋白（Ihh）的表达改动，为提醒颞下颌关节发育机制供给新的
途径。
1 资料与办法
1.1 试验动物 BAL B/C重生乳鼠5只，上海斯莱克试验动物有限责任公司购买雌性孕鼠出产，动物合格证号：SCXK（沪）字第2012-0002号。试验室室温稳定（22±1）℃，湿度（56±5）%，紫外线定时消毒，自在摄食饮水，给予质量分数为0.3%的钠饮食。
1.2 试剂和仪器 磷酸盐缓冲液（PBS，pH = 7.4，美国Hyclone公司）；Ihh（1∶200；ab39634）、ColⅡ（1∶200；ab53047）、ColⅠ（1∶500；ab34710）和蛋白聚糖（Aggrecan）（1∶500；ab36861）抗体（美国Abcam公司）；枸橼酸盐缓冲液（pH = 6.0，美国Sigma公司）；山羊血清，通用型二步法检测试剂盒（含质量分数为3%的过氧化氢去离子水和多聚辣根酶符号羊抗兔IgG即二抗）以及DAB显色试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific公司）；光学显微镜（德国徕卡公司）；白腊切片机（德国徕卡公司）；生物安排白腊包埋机（孝感亚光医用电子技能有限公司）。
1.3 取 材 空气栓塞法处死重生乳鼠，当即放入PBS中，取下头部置于质量分数为4%的多聚甲醛4 ℃ 固定24 h，Kristense液脱钙1周，惯例脱水、通明、浸蜡、包埋、切片备用。
1.4 免疫安排化学技能染色 室温下白腊安排切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，将切片放入
10 mol·L-1枸橼酸盐缓冲液（pH = 6.0）的电炉锅内，锅内的水沸腾开端计时20 min，进行抗原修正，然后天然冷却到室温。山羊血清（1∶10）关闭非特异性染色，室温孵育15 min；然后别离参加一抗ColⅠ（1∶500）、ColⅡ（1∶200）、Aggrecan（1∶500）和Ihh（1∶200），PBS代替一抗作为阴性对照，4 ℃过夜；PBS洗刷后参加二抗（羊抗兔，1∶1000），37 ℃孵育20 min，再按试剂盒的说明书，ABC复合物处理，DAB显色，封片。光学显微镜下调查颞下颌关节免疫组化染色的
形状。
1.5 阳性细胞判别规范 颞下颌关节呈现棕黄色颗粒为阳性细胞，调查蛋白的散布、阳性强度和阳性率。按染色强度打分：-为无色，+为浅黄色，++为棕黄色，+++为棕褐色，染色强度需与布景色相比照。
2 结 果
免疫组化染色成果定位明晰，布景明晰，阳性颗粒清楚。ColⅡ在关节盘与髁状突软骨中均表达强阳性，Aggrecan特异性表达于髁状突软骨中，ColⅠ在关节盘中表达阳性可是髁状突软骨中仅见少数表达，Ihh在关节盘中表达强阳性、髁状突软骨表达显着较少。ColⅡ与Aggrecan的表达方位强弱根本共同，ColⅠ与Ihh的表达方位根本共同。见图1-图5。
3 讨 论
软骨基质首要由胶原纤维和蛋白多糖构成，具有缓解关节应力，保持关节周围安排拉伸功用的效果。ColⅠ和ColⅡ是颞下颌关节中最首要的胶原蛋白，它们经过集合分子构成关节盘、髁状突以及关节窝。Aggrecan是最首要的蛋白多糖，以聚合体的办法存在，被包绕在胶原纤维间基质内，保持胶质网状结构充盈且具有高度弹性，也是软骨构成和骨骼发育的根本物质。蛋白聚糖与通明质酸结合构成复合物，游离于关节液中，构成高度的粘弹性，对关节软骨起着减震和光滑等机械维护效果[6]。
在正常的成长发育进程中，髁状突的成长办法归于软骨内成骨，软骨内成骨始于增殖层内未分解的间充质细胞的增殖和分解，促进前体软骨细胞分解为软骨细胞，再逐步老练分解为前肥壮软骨细胞和肥壮软骨细胞，软骨基质由Ⅱ型胶原转变为X型
胶原，之后重生血管长入，肥壮软骨细胞发作程序性逝世，部分矿化的软骨逐步被骨代替。
Ihh是豪猪蛋白宗族的一员，在颞下颌关节髁状突的发育进程中发挥重要效果，与髁状突成长、软骨的表型、软骨祖细胞的功用有关，一起是关节盘和关节腔构成的必要条件。胚胎发育前期，Ihh在颞下颌关节髁状突内已经有较强表达，Ihh受体及其效应基因Gli 1、Gli 2和Gli 3的表达规模已达髁状突外层的多形软骨细胞层和关节盘原基。在重生小鼠颞下颌关节的软骨和软骨膜中，Ihh基因明显表达[7]，这与本试验的研讨成果共同。Ihh基因敲除小鼠的髁突安排不能正常成长，结构紊乱，表现为细胞的增殖速率明显下降，具有增殖和分解功用的间充质细胞数量削减，软骨细胞的数量不足以保持髁突软骨的正常成长。一起，重生小鼠髁状突软骨内Ihh缺少的一起伴随着ColⅠ、ColⅡ和Aggrecan表达改动，终究导致髁状突外表纤维软骨的特性改动[8]。
试验标明，ColⅡ和Aggrecan一起在髁状突软骨中高表达，ColⅠ首要在关节盘中表达，关节盘首要成分为纤维软骨，ColⅠ为纤维软骨所独有，或许是因为在颞下颌关节构成和发育进程中，ColⅠ
具有保持骨结构的完好及骨生物力学特性，而ColⅡ和Aggrecan则经过构成软骨基质，促进软骨细胞的分解，然后促进软骨的构成及骨骼发育。Ihh在重生乳鼠颞下颌关节的关节盘和髁状突中均有表达，或许因其在保持关节盘骨生物学特性、促进髁状突软骨发育中均发挥重要效果。本试验运用免疫组化染色法检测了乳鼠发育期颞下颌关节各部位Ihh、ColⅡ、ColⅠ和Aggrecan的表达改动，目标定位精确直观，且操作简洁，试验费用低，具有同类试验其他办法所不具备的优势。
现在，影响颞下颌关节发育的要素没有彻底探明，如调控颞下颌关节安排间相互关系的信号分子的类型、关节盘构成进程对关节窝的影响等。未来的研讨中，能够测验运用试验胚胎学或许运用基因敲除小鼠模型进行研讨，进一步说明颞下颌关节发育的细胞和分子学机制。
4 参考文献
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[2] Li X，Liu H，Gu S，et al.Replacing Shox2 with human SHOX leads to congenital disc degeneration of the
temporomandibular joint in mice[J].Cell Tissue Res，2014，355（2）：345-354.
[3] Li X，Liang W，Ye H，et al.Overexpression of Indian hedgehog partially rescues short stature homeobox 2-overexpression-associated congenital dysplasia of the temporomandibular joint in mice[J].Mol Med Rep，2015，12（3）：4157-4164.
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[7] Hinton RJ，Serrano M，So S.Differential gene expression in the perichondrium and cartilage of the neonatal mouse temporomandibular joint [J].Orthod Craniofac Res，2009，12（3）：168-177.
[8] Li X，Liang W，Ye H，et al.Overexpression of Shox2 leads to congenital dysplasia of the temporomandibular joint in mice[J].Int J Mol Sci，2014，15（8）：13135-13150.
收稿日期：2016-04-20；修回日期：2016-07-22
