马武开+侯雷+曾苹+宁乔怡+姚血明+和秀美+王莹
【摘 要】意图：讨论中药润燥灵方对枯燥综合征模型小鼠免疫器官的影响及其抗炎效果。办法：将90只C57bl/6j小鼠随机分为空白对照组，模型对照组，醋酸泼尼松组和润燥灵高、中、低剂量组，每组15只。除空白对照组外，其他各组选用免疫诱导法树立枯燥综合征小鼠模型，造模第5周开端灌胃给药。空白对照组、模型对照组均给予蒸馏水0.2 mL·d-1灌胃，醋酸泼尼松组给予醋酸泼尼松混悬液2 mg·kg-1·d-1灌胃，润燥灵高、中、低剂量组别离给予润燥灵50，25，12.5 g·kg-1·d-1灌胃。用药4周后眼球取血，乌拉坦麻醉后断颈处死小鼠，别离颌下腺、胸腺和脾脏，核算小鼠颌下腺、胸腺和脾脏指数，HE染色调查病理变化，ELISA法检测小鼠血清白细胞介素-17（IL-17）的排泄状况。成果：颌下腺指数研讨成果显现，润燥灵高剂量组小鼠颌下腺指数较模型对照组显着添加（P ﹤ 0.05），与醋酸泼尼松组适当（P ﹥ 0.05）。胸腺和脾脏指数研讨显现，与模型对照组比较，润燥灵高剂量组和醋酸泼尼松组均能显着下降枯燥综合征小鼠胸腺和脾脏指数（P ﹤ 0.05或P ﹤ 0.01），而中、低剂量组影响不显着（P ﹥ 0.05）。病理成果研讨显现，与模型对照组比较，润燥灵高剂量组能够显着改进枯燥综合征小鼠颌下腺、胸腺和脏脾的病理变化，而中、低剂量组不显着。ELISA检测成果显现，模型对照组小鼠IL-17排泄量添加（P ﹤ 0.01）；与模型对照组比较，润燥灵高、中剂量组均能下降IL-17的排泄量
（P ﹤ 0.05），低剂量组下降不显着（P ﹥ 0.05）。定论：润燥灵具有下降枯燥综合征模型小鼠颌下腺指数，下调IL-17排泄的效果。
【要害词】 枯燥综合征；润燥灵；颌下腺；胸腺；脾臟；免疫器官；IL-17；小鼠
On the Immunoregulation and Anti-inflammation of Runzao Ling（润燥灵）on Model Mice
with Sj?gren's Syndrome
MA Wu-kai，HOU Lei，ZENG Ping，NING Qiao-yi，YAO Xue-ming，HE Xiu-li，WANG Ying
【ABSTRACT】Objective：To investigate the effects of Runzao Ling（润燥灵）on immune organs in mice with sj?gren's syndrome and its anti-inflammatory effects.Methods：Ninety C57bl/6j mice were randomly divided into a blank control group，a model control group，a prednisone acetate group and Runzao Ling groups （with high，medium and low doses），15 rats in each group.Except for the blank control group，the mice in other groups were induced by immune induction to establish the models with sj?gren's syndrome，and the models were given intragastric administration from the fifth week.The rice in the blank control group and the model control group were given intragastric administration of distilled water （0.2 mL·d-1）.The mice in the prednisone group were given intragastric administration of prednisone suspension （2 mg·kg-1·d-1）.The mice in the Runzao Ling groups （with high，medium and low doses） were given intragastric administration of Runzao Ling （50，25，12.5 g·kg-1·d-1 respectively）.After
4 weeks of treatment，the eye blood was taken and the urethane anesthetized mice were killed.The submandibular gland，thymus and spleen of the killed mice were separated to calculate their index.Their pathological changes were observed by HE staining and the ELISA method was used to detect the secretion of IL-17 in the serum.Results：The submandibular gland index in the high-dose Runzao Ling group were significantly higher than those in the model control group（P < 0.05），and were almost equivalent to those of the prednisone group（P > 0.05）.Compared with the model group，the high-dose Runzaoling group and the prednisone group could significantly reduce the index of thymus and spleen in mice with sj?gren's syndrome（P < 0.05 or P < 0.01），while there was no obvious effects in the medium and low dose groups（P > 0.05）.The pathological results showed that compared with the model control group，the high-dose Runzao Ling group could obviously improve the pathological changes of the submandibular gland，thymus and spleen in the mice with sj?gren's syndrome，but those in the middle and low dose groups are not obvious.ELISA test results showed that IL-17 secretion of mice in the model group increased （P < 0.01）.Compared with the model group，medium and high dose groups of Runzao Ling could reduce the secretion of IL-17（P < 0.05），while that in the low-dose group did not significantly decrease（P > 0.05）.Conclusion：Runzao Ling can reduce the submandibular gland index and down regulate the secretion of IL-17 in model mice with sj?gren's syndrome.
【Keywords】 sj?gren's syndrome；Runzao Ling（润燥灵）；submandibular gland；thymus；spleen；immune organ；IL-17；mice
枯燥综合征（sj?gren's syndrome，SS）是一种以侵略外排泄腺为首要病理特征的本身免疫性疾病，临床以口、眼枯燥，关节痛苦及多体系危害为主。SS的发病机制尚不清楚，现在尚无特效医治药物，临床多选用对症医治改进口眼枯燥为主。SS属中医学“燥证”“燥痹”领域。SS患者大多数具有口眼枯燥、皮肤皲裂等阴虚炎热之象，既往中医医治常根据临床体现从滋阴润燥下手，但效果并不抱负。为此，笔者根据SS的发病特色，提出津枯血瘀、炎热成毒的发病机制，从清热解毒、活血生津下手，组成润燥灵汤，经过前期的临床调查和试验研讨，获得了杰出效果[1]。为进一步清晰其免疫调理机制，笔者经过免疫诱导法树立SS模型小鼠，讨论润燥灵方对SS模型小鼠的抗炎和免疫调理效果。
1 试验材料
1.1 试验动物 C57bl/6j小鼠90只，雌性，8周龄，SPF级，体质量（20.24±2.55）g，购自重庆腾鑫生物技能有限公司，动物许可证号：SCXK（軍）2012-0011。Lewis大鼠20只，雌性，8周龄，SPF级，体质量（150±20.70）g，购自北京维通利华试验动物技能有限公司，动物许可证号：SCXK（京）2012-0001。均养殖于清洁级环境中。
1.2 试验药物 中药饮片由本院中药房供给，润燥灵由肿节风10 g、金银花10 g、白花蛇舌草10 g、当归10 g、赤芍15 g、生地黄15 g、玄参15 g等组成。上药加水浸泡10 min，煎煮2次，每次30 min，
兼并滤液，浓缩成浓度5 g·mL-1，4 ℃冰箱保存备用。醋酸泼尼松龙片（浙江仙琚制药有限公司，出产批号1403104）。
1.3 试验试剂 百白破疫苗（武汉生物制品股份有限公司，出产批号20140104-2，由贵州省湄潭县卫生防疫站供给）；弗氏彻底佐剂（SIGMA，SLBJ2845V贵州永博鑫生物科技有限公司）；考马斯亮兰试剂盒（南京建成生物工程研讨所，出产批号20140710）；TRNzol-A总RNA提取试剂（天根生化科技北京有限公司，DP421）；StarScript Ⅱ First-stand cDNA Synthesis Mix（北京康润诚业生物科技有限公司，A214）；2×Taq PCR StarMix with Loding Dye（北京康润诚业生物科技有限公司，A112-10）；Mouse IL-17A Sunny ELISA Kit（联科生物技能有限公司，221741141）。
1.4 试验仪器 酶标仪（美国Bio Tek，EL × 800 V）；电泳仪（北京六一仪器厂，DYY-6C）；电子天平（常熟市天量仪器有限责任公司，Mettler toledo，AB104-N）；超纯水机（北京爱思泰克公司，ASTK，CSR-1-30型）；电热鼓风恒温枯燥箱（上海一恒医疗器械有限公司，DHG-9070A）；制冰机（商丘艾斯比尔制冷设备有限公司，ZBJ-100PZ）；立式压力蒸汽灭菌锅（上海三申医疗器械有限公司，YM50Z）。
2 方 法
2.1 分组办法 将90只C57bl/6j小鼠随机分为空白对照组，模型对照组，醋酸泼尼松组和润燥灵高、中、低剂量组，每组15只。
2.2 模型树立 参照Cutler办法[2]，选取Lewis大鼠10只，选用质量分数为20%的乌拉坦麻醉后断颈处死，无菌别离颌下腺，电动匀浆，4 ℃，1000 r·min-1离心15 min，弃上清，向沉积中参加1 mL PBS，再次匀浆、离心，重复4次。选用考马斯亮蓝比色法，测定抗原浓度为8.7 mg·mL-1，参加PBS稀释抗原浓度至2 mg·mL-1；再参加同体积弗氏彻底佐剂，制备成终究抗原浓度为
1 mg·mL-1。C57bl/6j小鼠背部、腹部消毒后皮下多点打针抗原（每只0.2 mL），第2天予背部、腹部打针百白破疫苗0.5 mL，尔后别离于第14天和第28天各加强免疫1次。
2.3 给药办法 从造模第4周开端灌胃给药，给药剂量按成人与小鼠体质量换算，以等效剂量为润燥灵中剂量，2倍为高剂量，1/2为低剂量。空白对照组、模型对照组均给予蒸馏水0.2 mL·d-1灌胃，醋酸泼尼松组给予等效剂量（2 mg·kg-1·d-1）醋酸泼尼松混悬液灌胃，润燥灵高、中、低剂量组别离给予润燥灵液50，25，12.5 g·kg-1·d-1灌胃。接连用药4周，于第28天末次给药2 h后眼球取血，选用质量分数为20%的乌拉坦麻醉后断颈处死小鼠，无菌别离小鼠颌下腺、胸腺、脾脏进行病理检测。
2.4 器官指数测定 无菌别离小鼠颌下腺、胸腺、脾脏，电子天平秤量质量，核算小鼠颌下腺、胸腺、脾脏指数。免疫器官指数=各免疫器官质量（mg）/
小鼠体质量（g）。
2.5 病理检测 将别离的小鼠颌下腺、胸腺、脾脏等免疫器官用质量分数为4%的多聚甲醛固定，白腊包埋，切片，HE染色，在光镜下调查各免疫器官的病理变化。
2.6 IL-17的检测 选用ELISA法，按试剂盒阐明书进行操作。按规范品浓度进行稀释、洗板、加样、温育、洗板、加酶、温育、显色、停止、测定等过程进行，最终拟定规范曲线。以规范品浓度为横坐标，OD值为纵坐标，用核算机软件进行回归拟合生成规范曲线。将样品OD值代入规范曲线核算出IL-17浓度。
2.7 统计学办法 选用SPSS 22.0软件进行统计剖析。计量材料以表明，多组间比较用单因素方差剖析。方差齐时，各组间两两比较选用LSD查验；方差不齐时，则选用Tamhance's T2检
验。以P < 0.05为差异有统计学含义。
3 结 果
3.1 润燥灵对SS模型小鼠免疫器官指数的影响
与空白对照组比较，模型对照组小鼠颌下腺指数下降（P < 0.05），胸腺和脾脏指数升高（P < 0.01）。与模型对照组比较，醋酸泼尼松组和润燥灵高剂量组颌下腺指数均升高，差异有统计学含义（P < 0.05）。与模型对照组比较，各医治组胸腺、脾脏指数均有不同程度下降，以醋酸泼尼松组和润燥灵高剂量组下降较为显着，差异有统计学含义（P < 0.05或P < 0.01）。见表1。
3.2 润燥灵对SS模型小鼠免疫器官病理的影响
3.2.1 润燥灵对颌下腺病理的影响 空白对照组颌下腺腺泡巨细均匀，摆放规整。模型对照组颌下腺小叶结构消失，腺泡、腺管结构紊乱，上皮细胞变性，溶解坏死，细胞周围导管增生，导管上皮细胞堆叠，腺泡周围小血管增生、扩张、充血，细胞间可见少数浆细胞、淋巴细胞滋润。醋酸泼尼松组和润燥灵高剂量组颌下腺小叶结构根本存在，腺泡、导管散布均匀，摆放稍紊乱，部分腺泡上皮细胞增生。润燥灵中、低剂量组颌下腺小叶结构消失，腺泡、腺管结构紊乱，部分小血管扩张、充血。见图1。
3.2.2 润燥灵对胸腺病理的影响 空白对照组胸腺皮质、髓质结构清楚，散布均匀，可见胸腺小体散在散布。模型对照组胸腺皮质、髓质结构紊乱，髓质区上皮细胞增生，皮质区淋巴细胞散布较多。醋酸泼尼松组和润燥灵高剂量组胸腺皮质、髓质结构尚存，髓质区胸腺上皮细胞轻度增生。润燥灵中剂量组胸腺皮质、髓质结构稍紊乱，髓质区胸腺上皮细胞轻度增生，皮质区萎缩。润燥灵低剂量组胸腺皮质、髓质结构紊乱，髓质区胸腺上皮细胞增生，皮质区淋巴细胞较润燥灵中剂量组增多。见
图2。
3.2.3 润燥灵对脾脏病理的影响 脾脏病理成果显现，空白对照组脾脏被膜散布均匀，红髓、白髓散布规整，摆放均匀。模型对照组脾脏结构广泛损坏，白髓及脾小体增生显着，见很多淋巴细胞、单核巨噬细胞及多核巨噬细胞增生，红髓萎缩显着，脾血窦结构不清。醋酸泼尼松组脾脏被膜散布较均匀，红髓、白髓散布较规整，摆放较均匀，脾血窦散布于脾小体之间。润燥灵高剂量组脾红髓、白髓散布不规则，摆放不均匀，伴有白髓区域淋巴细胞轻度增生。润燥灵中剂量组脾脏部分结构损坏，白髓区域淋巴細胞、多核巨噬细胞显着增生。润燥灵低剂量组脾脏结构广泛损坏，病理体现挨近模型对照组。见图3。
3.3 润燥灵对SS模型小鼠血清IL-17排泄的影响
每组随机抽取10只小鼠血清进行ELISA检测，成果显现，模型对照组小鼠IL-17的排泄量显着高于空白对照组（P < 0.01），各给药组均能不同程度下降小鼠血清IL-17的排泄量，其间醋酸泼尼松组和润燥灵高、中剂量组下降比较显着（P < 0.01）。润燥灵中、低剂量组与醋酸泼尼松组比较，差异有统计学含义（P < 0.01）。见表2。
4 讨 论
SS属中医学“燥毒”“燥证”“燥痹”等领域。根据SS的发病特色，笔者以为阴虚、燥毒、瘀血是发病的首要病因[3]，以毒蕴血瘀为根据组成润燥灵方，经前期的临床研讨证明对改进SS临床症状和体征具有较好效果[1]。课题组在前期的动物试验中发现，润燥灵方能够下调SS模型小鼠涎腺安排水分子通道蛋白1，5（AQP1、AQP5）的表达，改进模型小鼠的饮水量[4-7]。方中君药肿节风清热解毒；臣药金银花、白花蛇舌草，助君药清热解毒；佐药当归、赤芍活血化瘀；使药生地黄、玄参养阴生津。诸药合用，具有解毒、活血、生津之功，在清热解毒的一起，辅以活血化瘀、生津润燥。本研讨经过润燥灵对SS模型小鼠的干涉医治研讨，发现SS模型对照组小鼠颌下腺指数较空白对照组显着减小，阐明SS小鼠腺体结构发作改动。除润燥灵低剂量组外，用药组颌下腺指数均大于模型对照组，醋酸泼尼松组及润燥灵高、中剂量组均能减轻SS小鼠颌下腺病理损害，其间醋酸泼尼松组与润燥灵高剂量组颌下腺指数无显着差异，2组对SS小鼠颌下腺病理损害的医治效果适当。胸腺是T细胞分解及发育的场所，当T细胞增值时，胸腺的体积及质量会添加[8]。脾脏是机体最大的外周淋巴器官，其间有很多T、B淋巴细胞，当这些细胞遭到抗原影响时，T、B淋巴细胞会克隆增殖，导致脾脏的体积及质量添加，所以脾脏和胸腺指数也可直接反响机体的免疫状况[8-9]。本试验经过丈量胸腺及脾脏指数，发现模型对照组小鼠胸腺及脾脏指数较空白对照组显着增大，阐明模型对照组小鼠处于免疫亢进的状况。各用药组小鼠胸腺及脾脏指数均小于模型对照组，润燥灵高剂量组胸腺及脾脏指数与空白对照组比较，差异无统计学含义
（P ﹥ 0.05）。研讨成果阐明中药润燥灵对免疫器官有必定的调理效果。
病理研讨发现，醋酸泼尼松组及润燥灵高剂量组均对颌下腺有医治效果，能够削减浆细胞、淋巴细胞的滋润，康复颌下腺的正常生理结构，而润燥灵中、低剂量对SS模型小鼠颌下腺的病理影响不显着。阐明润燥灵高剂量组能够有用调理胸腺的免疫状况，而润燥灵中、低剂量组对胸腺的调理效果较差。脾脏病理切片成果显现，醋酸泼尼松组较润燥灵高剂量组对脾脏的免疫调理效果强，而润燥灵中、低剂量对脾脏的免疫调理效果较小。
Th17细胞是一种新式CD4+Th细胞亚群，首要排泄IL-17、IL-6、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等炎性细胞因子，诱发炎症反响。有研讨证明，IL-17与SS患者的腮腺肿大显着相关[10]。SS患者血清IL-17的排泄水平升高，尤其是抗核抗体滴度高和类风湿因子阳性的患者更显着[11]。IL-17作为Th17细胞与本身免疫疾病之间的要害枢纽，是Th17细胞排泄的代表性因子，具有激烈的促炎效果，能够诱导促炎细胞因子和趋化因子，影响基质金属蛋白酶表达，导致急性期反响蛋白发作，引起安排损坏[12]。在本身免疫疾病的医治过程中运用调控IL-17阻断炎症效果的办法，能够获得较好的效果。本次试验中笔者运用中药润燥灵对SS模型小鼠血清IL-17的排泄状况进行研讨，成果显现，醋酸泼尼松组及润燥灵高、中、低剂量组均能下调IL-17的表达，然后按捺炎症反响发作。润燥灵高剂量组效果比较显着，润燥灵中、低剂量组下调IL-17的效果不及醋酸泼尼松及润燥灵高剂量组。
综上所述，中药润燥灵能添加SS模型小鼠颌下腺指数，下降胸腺和脾脏指数，并下降SS模型小鼠血清IL-17排泄量；调理SS模型小鼠免疫功用，下降致炎因子IL-17表达，到达医治SS的效果。
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收稿日期：2017-03-17；修回日期：2017-04-25
