张佳慧，陈赛楠，陈文列，黄云梅，林如辉，黄美雅，吴银生，郑良朴，李钻芳，刘献祥
【摘 要】意图：调查彻骨消痛胶囊对骨质疏松性骨关节炎模型软骨与软骨下骨结构的影响，为讨论医治该类型骨关节炎供给根据。办法：将18只新西兰大白兔分为正常组、模型组、中药组。除正常组外，其他2组先诱导骨质疏松，再树立膝骨关节炎模型。正常组与模型组给予生理盐水，中药组给予彻骨消痛胶囊灌胃4周。HE和番红-固绿染色，光镜调查软骨结构；显微CT调查软骨下骨，剖析骨小梁参数；扫描电镜调查软骨下骨微细结构。成果：模型组软骨损害，基质蛋白多糖浅染，Mankin评分达中期损害；软骨下骨骨小梁结构损坏，参数改动；胶原纤维等微细结构损害。中药组软骨损害减轻，基质深染，Mankin评分为前期损害；软骨下骨骨小梁结构和参数改进；胶原纤维等微细结构改进。定论：彻骨消痛胶囊能改进骨质疏松性骨关节炎模型软骨结构与基质病变，减轻软骨下骨微结构损坏，故可推迟该类型骨关节炎病理进程。
【关键词】 骨关节炎；骨质疏松性骨关节炎；彻骨消痛胶囊；软骨；软骨下骨；兔
Intervention of Tougu Xiaotong Jiaonang（彻骨消痛胶囊）in Cartilage and Subchondral Bone Structure of Rabbit Models with Osteoporotic Osteoarthritis in Knees
ZHANG Jia-hui，CHEN Sai-nan，CHEN Wen-lie，HUANG Yun-mei，LIN Ru-hui，HUANG Mei-ya，WU Yin-sheng，
ZHENG Liang-pu，LI Zuan-fang，LIU Xian-xiang
【ABSTRACT】Objective：To observe the effects of Tougu Xiaotong Jiaonang（彻骨消痛胶囊）on cartilage
and subchondral bone structure of rabbit models with osteoporotic osteoarthritis in knees to provide the basis for the treatment of this type of osteoarthritis.Methods：Eighteen New Zealand white rabbits were divided into a normal group，a model group and a Chinese medicine group.Except for the normal group，osteoporosis were induced in the other two groups to establishing models with knee osteoarthritis.The normal group and the model group were given normal saline，while the Chinese medicine group was given intragastric administration of Tougu Xiaotong Jiaonang for 4 weeks.After HE and safranine fast green staining，the cartilage structure was observed under the light microscopy.Micro CT was used to observe the subchondral bone to analyze the trabecular bone parameters.The subchondral bone microstructure was observed with scanning electron microscope.Results：In the model group，the cartilage was damaged，the matrix proteoglycan was understained，and Mankin score showed the medium-term injury.The subchondral bone trabecular structure was destructed and the parameter changed.Fine structures such as collagen fiber were damaged.In the Chinese medicine group，the cartilage damage was relieved，the matrix was deeply stained，and the Mankin score showed early damage.The trabecular bone structure and parameters were improved.The collagen fiber and other fine structures were also improved.Conclusion：Tougu Xiaotong Jiaonang can improve the cartilage structure and matrix lesions in models with osteoporotic osteoarthritis and reduce the damage to subchondral bone microstructure to delay the pathological process of this type of osteoarthritis.
【Keywords】 osteoarthritis；osteoporotic osteoarthritis；Tougu Xiaotong Jiaonang（彻骨消痛膠囊）；cartilage；endprint
subchondral bone；rabbits
骨关节炎（osteoarthritis，OA）的特征为软骨变性、软骨下骨损坏、骨赘增生等[1]。骨质疏松（osteoporosis，OP）表现为骨强度受损、骨安排微结构损坏、骨脆性添加[2]。临床上存在OP性OA，其特征是软骨下骨疏松易脆，被继续添加骨重塑诱导并导致软骨下微骨折和磨损，然后加快OA开展，并且跟着年纪添加，OP性OA发作率不断添加[3-4]。现在的研讨较少重视OP性OA，大多数研讨仅会集在OA的软骨结构改动或OP的软骨下骨结构改动[5-6]。而关节软骨和软骨下骨之间又存在亲近的生物力学联系，软骨下骨的力学性能可影响关节软骨的完好性，引发软骨退变[7-8]。因而，研讨OP性OA中软骨和软骨下结构改动具有重要含义。
中医学以为，OA与OP两者均以肾虚为本，均是全身退行性改动，补肾法可以有用医治OA和OP[9]。彻骨消痛胶囊由巴戟天、白芍、川芎、肿节风组成，具有补肾柔肝、活血祛风等成效，长时刻用于临床医治OA疗效显着[10]。前期研讨标明，彻骨消痛胶囊能减轻软骨损害[11]，促进成骨细胞的增殖和骨钙素的排泄[12]；能改进软骨下骨重塑和硬化[13]。故根据肾虚是OA和OP的一起病机，该药对OP性OA也或许有药效效果，但对OP性OA干涉效果没有见报导。本试验拟经过彻骨消痛胶囊干涉OP性OA模型，调查软骨与软骨下骨结构改动，为探究在临床上运用该药医治OP性OA的或许性供给试验与理论根据。
1 试验材料
1.1 试验动物 18只6月龄一般级雌性新西兰大白兔，体质量1.8～2.1 kg，由上海市松江区松联试验动物场供给，动物许可证号：SCXK（沪）2012-0011。动物养殖于福建中医药大学试验动物中心，运用许可证号：SYXK（闽）2009-0001。
1.2 试验药物和儀器 彻骨消痛胶囊（福建中医药大学隶属第二人民医院院内制剂，闽制字Z20100006）；光学显微镜（德国徕卡公司）；小动物显微CT（广州中科恺盛医疗科技有限公司）；台式扫描电镜（日本日立高新技术公司）。
2 方 法
2.1 动物分组与模型制备 将18只新西兰大白兔随机分为正常组、模型组、中药组，每组6只。除正常组外，其他2组以质量分数为3%的戊巴比妥钠按30 mg·kg-1剂量耳缘静脉注射麻醉，手术切除双侧卵巢诱导OP[14]。4周后，选用改进Hulth法[15]树立右膝OA模型，堵截内侧副韧带，完好去除内侧半月板，堵截前穿插韧带。手术后1周，每日逼迫动物活动30 min，接连4周，树立OP性OA模型。
2.2 动物给药与选材 OP性OA模型树立后，中药组用彻骨消痛胶囊1.86 g·kg-1·d-1灌胃，正常组与模型组用等量生理盐水灌胃，每日1次，接连4周。用药完毕后，选用空气栓塞法处死试验动物，取右膝股骨、胫骨，置于质量分数为4%的多聚甲醛中。
2.3 软骨HE染色调查 股骨经质量分数为4%的多聚甲醛固定3 d，质量分数为10%的EDTA脱钙16周，取股骨内髁沿矢状面切开，再用乙醇脱水，二甲苯通明，浸蜡，白腊包埋。白腊切片4 μm，脱蜡至水，苏木素染色30 min，分解，伊红速染1 s，二甲苯通明，中性树胶封片，光镜下调查软骨安排病理改动、拍摄。
2.4 软骨番红-固绿染色调查 股骨切片脱蜡，用质量分数为1%的番红染色10 min，质量分数为0.02%的固绿染色3 min，体积分数为95%的乙醇分解3 s，质量分数为1%的番红复染3 min，通明、封片，光镜调查、拍摄。
2.5 软骨Mankin评分 根据HE染色、番红-固绿染色，参照Mankin评分标准[16]，评价软骨病变程度，根据软骨外表结构、细胞摆放、番红染色程度、潮线完好性等进行病程分期，1～5分为前期OA，6～9分为中期OA，10～14分为晚期OA。
2.6 软骨下骨Micro-CT调查 经质量分数为4%的多聚甲醛固定的胫骨，置于Micro-CT查看槽，沿胫骨长轴方向扫描，条件为电压60 KV、电流666 μA、功率40 W，分辨率50 μm，扫描30 min，
图画二值化。扫描图片后三维重建，别离调查软骨下骨胫骨渠道、矢状面、横断面，并挑选胫骨软骨下骨相同图画方位的感兴趣区域，进行骨小梁参数剖析，包含骨密度（BMD）、骨小梁数量（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁别离度（Tb.Sp）、骨体积分数（BV/TV）。
2.7 软骨下骨扫描电镜调查 Micro-CT调查后，于胫骨内侧1/3处用刀片断开；先后用PBS、蒸馏水充沛清洗骨髓腔，再用体积分数为30%、50%、70%、90%、100%的叔丁醇脱水，真空枯燥后将样本定向固定于载物台，台式扫描电镜下调查。
2.8 统计学办法 选用SPSS 20.0软件进行统计剖析。计量材料以标明，正态性散布选用单因素方差剖析，方差齐选用LSD查验；非正态性散布选用非参数Kruskal-Wallis查验。以P < 0.05为差异有统计学含义。
3 结 果
3.1 软骨显微结构 正常组软骨外表润滑平坦，细胞数量较多，摆放规整。模型组软骨外表粗糙有裂隙、纤维增多，细胞数量弥漫性增多，有簇集样细胞团，摆放紊乱。中药组软骨损害程度较模型组轻，外表较润滑，细胞摆放较规整，数量略添加。见图1。
3.2 软骨蛋白多糖 番红能与酸性蛋白多糖结合，将软骨基质染成粉红色；固绿可与含碱性氨基酸的胶原纤维结合将软骨下骨染成蓝绿色[17]。正常组软骨基质被染成均匀粉红色，蛋白多糖较丰厚；软骨放射层与钙化层接壤的潮线明晰可见；软骨下骨胶原纤维被染成蓝绿色，钙化层与软骨下骨板分界的黏合线明晰，呈锯齿状。模型组软骨基质番红染色重度减退，蛋白多糖较少；可见潮线不齐；黏合线呈波涛状。中药组软骨基质番红染色加深，乃至深于正常组，蛋白多糖丰厚；潮线可见；黏合线也呈波涛状。见图2。endprint
3.3 3组软骨Mankin评分比较 与正常组比较，模型组Mankin评分添加（P < 0.01），标明软骨损害添加，归于中期OA；与模型组比较，中药组Mankin评分下降（P < 0.05），标明软骨损害减轻，为前期OA。见表1。
3.4 软骨下骨微结构Micro-CT调查 从胫骨渠道结构三维重建图可见，正常组胫骨渠道外表平坦、润滑，未见骨赘构成。模型组胫骨渠道外表粗糙不平，边际有骨赘凸起。中药组胫骨渠道外表不平坦，边际有比模型组小的骨赘。见图3。
从矢状面结构三维图可见，正常组软骨下骨骨小梁摆放规整、衔接性好；骺端Tb.N较多。模型组软骨下骨骨小梁摆放紊乱，距离较大，部分开裂；骺端骨小梁很多消失。中药组软骨下骨骨小梁摆放较为规整、均匀；骺端Tb.N较模型组添加。见
图4。
从横断面二维图可见，正常组骨小梁从四周向中部摆放均匀有序，呈均匀网状交错结构。模型组边际骨小梁摆放无序紊乱，部分细密增生，部分歪曲开裂，边际有骨赘。中药组骨小梁摆放较规整，部分骨小梁少数添加，无显着开裂，衔接性较好，仍可见交错网状结构，边际一侧有部分骨赘，骨小梁结构较模型组改进，挨近正常组结构。见图5。
3.5 3组软骨下骨骨小梁参数比较 与正常组比较，模型组BMD、Tb.Th和BV/TV显着下降（P < 0.05
或P < 0.01），Tb.N、Tb.Sp均发作改动；与模型组比较，中药组的BV/TV显着添加（P < 0.05），BMD、Tb.N、Tb.Th和Tb.Sp改进，且较挨近正常组水平。见表2。
3.6 软骨下骨微细结构扫描电镜调查 从骨小梁结构图可见，正常组软骨下骨骨小梁呈不规则立体网状结构，衔接性好，未见显着开裂，与软骨下骨板衔接处结构完好，能起到吸收应力效果。模型组软骨下骨骨小梁部分开裂、疏松，网状结构被损坏，吸收应力效果削弱。中药组骨小梁结构较模型组改进，未见显着开裂，仍可见部分网状结构，与软骨下骨板衔接处较为完好，能起到必定的吸收应力效果。见图6。
从胶原纤维结构图可见，正常组断面较润滑，胶原纤维及其结合的钙-磷等骨盐细密紧实。模型组断面粗糙，胶原纤维及骨盐松懈且有裂隙。中药组断面较润滑，胶原纤维间细密但有裂隙。见图7。
4 讨 论
在中医学中OA属“骨痹”领域，OP属“骨痿”领域，病位均在骨，为肾脏所主，而肝肾两脏联系亲近，因而两者的病机都是肝肾亏虚[18]。从西医学来看，中医的肾还联系着排泄、代谢、免疫等功用，对人体成长、发育有重要调理效果；临床上运用补肾中药医治OP性OA，具有进步骨密度、改进痛苦等效果[9]。因而，本研讨运用补肾柔肝中药彻骨消痛胶囊干涉OP性OA，可为临床医治供给试验根据。
关于OP性OA模型的造模办法，曾报导经过双侧卵巢切除术并添加皮质类固醇诱导OP模型后，再堵截前穿插韧带和去除内侧半月板手术诱导OA，树立复合模型[8]，但皮质类固醇或许会导致软骨损害[19]。因而，咱们选用双侧卵巢切除术和膝关节手术的造模办法[14，20]诱导OP性OA
模型。
软骨退变是OA最主要的病理改动，基质中蛋白多糖能招引水分子嵌在构成软骨网架结构的胶原中，坚持软骨的黏弹性；OP性OA发作时，胶原降解，蛋白多糖削减，引起软骨细胞功用改动，导致软骨退变[14，21]。研讨显现，彻骨消痛胶囊能显着添加蛋白多糖，乃至高于正常组，这标明中药或许是经过促进蛋白多糖的组成排泄，改进软骨基质成分，坚持软骨细胞正常生存环境，并坚持软骨黏弹性，然后有利于软骨修正，改进软骨结构，减轻软骨损害，推迟软骨退变，然后使中期OA减轻至前期。
软骨下骨可分为软骨下骨板和骨小梁两部分。软骨下骨板是薄的皮质骨，坐落钙化软骨深处；骨小梁互相衔接构成网状，起吸收应力、缓冲震动和支撑效果[22]。骨小梁的稳定性和强度与其微结构的形状有关，如骨小梁的形状、衔接方法和胶原纤维的走向、摆放等[23]。模型组软骨下骨胶原纤维粗糙松懈，骨小梁疏松、开裂，骨小梁参数剖析显现骨量下降，阐明该区域对立机械压力下降，并显现出较显着变形，导致机械性能改动，这或许与卵巢切除后雌激素水平下降、骨转换率升高、骨吸收添加有关。
中藥组与模型组比较，胶原纤维细密紧实，骨小梁摆放较有序，骨小梁参数剖析显现骨量添加等，阐明彻骨消痛胶囊能按捺OP性OA软骨下骨OP，改进软骨下骨机械性能。这或许与中药按捺骨吸收，促进骨构成，促进胶原纤维的修正，改进软骨下骨骨小梁的微结构，然后坚持其吸收应力效果，与恢复软骨下骨生物力学效果有关。软骨下骨参数改进若要悉数到达统计学差异，或许需延伸医治时刻，或是提早给药。
近年来研讨发现，软骨下骨改动、软骨下骨与软骨之间的相互效果，在OP性OA中有着重要效果[14]。软骨下骨结构的改动或许导致机械荷载应力的改动，会将更多的负荷传递给上面的软骨，导致软骨损害和退变进一步加剧[22]。软骨下骨OP，会使得骨安排微骨折添加，重复屡次微骨折会损害骨安排机械性能，使生物力学强度下降，关节软骨发作损害[24]，终究加快OP性OA开展。彻骨消痛胶囊或许经过改进软骨下骨结构和机械性能，减轻过度负荷传递给上面软骨，然后推迟软骨退变。
综上所述，彻骨消痛胶囊一方面经过促进蛋白多糖组成排泄，减轻软骨结构损害，推迟软骨退变；另一方面经过改进软骨下骨胶原纤维、骨小梁的微结构，进步骨量，改进软骨下骨的结构和机械性能，反过来又减轻软骨下骨上方软骨的负荷，维护软骨。本研讨成果阐明，彻骨消痛胶囊可改进兔膝OP性OA的软骨和软骨下骨结构，坚持其机械性能、推迟病理进程，提示可在临床上扩展用于医治OP性OA，并可用于预防性用药避免因OP导致的OA构成与开展。
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收稿日期：2017-06-14；修回日期：2017-08-03endprint
