马玉环+郑文伟+陈后煌+邵翔+陈达+叶蕻芝+李西海
【摘 要】意图：讨论牛膝多糖（ABPS）对大鼠膝关节软骨细胞Ⅱ型胶原及蛋白聚糖表达的影响。办法：取4周龄健康SD大鼠10只，别离膝关节，刮下双侧膝关节外表软骨安排，选用机械-Ⅱ型胶原酶消化法获取膝关节软骨细胞。树立软骨细胞体外培育体系，倒置相差显微镜调查细胞形状，选用
Ⅱ型胶原免疫组化法判定软骨细胞。体外培育到第2代软骨细胞，分别用0，50，100，200 μg·mL-1的ABPS对软骨细胞进行干涉。干涉后，Western blot检测各组Ⅱ型胶原、蛋白聚糖的表达改动，免疫荧光调查空白组与加药组Ⅱ型胶原的表达改动。成果：第2代软骨细胞的形状学标明软骨细胞的典型特征：软骨细胞含有丰厚的Ⅱ型胶原。Western blot检测成果显现，ABPS促进软骨细胞Ⅱ型胶原表达，而且在
100 μg·mL-1时表达最高，差异有统计学含义（P < 0.05）。一起100 μg·mL-1的ABPS干涉软骨细胞后，软骨细胞中的蛋白聚糖表达添加，但差异无统计学含义（P > 0.05）。与空白组的Ⅱ型胶原荧光表达比较，ABPS干涉后软骨细胞的Ⅱ型胶原荧光表达更强。定论：ABPS促进了软骨细胞Ⅱ型胶原及蛋白聚糖的表达。
【关键词】 骨关节炎；牛膝多糖；Ⅱ型胶原；蛋白聚糖；软骨细胞；大鼠
Effect of ABPS on the Expressions of TypeⅡCollagen and Proteoglycan of Cartilage Cells
MA Yu-huan，ZHENG Wen-wei，CHEN Hou-huang，SHAO Xiang，CHEN Da，YE Hong-zhi，LI Xi-hai
【ABSTRACT】 Objective：To investigate the effect of Achyranthes bidentata polysaccharides（ABPS） on the expressions of typeⅡcollagen and proteoglycan in cartilage cells.Methods：Ten 4-week-old healthy SD rats were used to isolate the knee joints，scrape cartilaginous tissue off the surface of the knee joint，and get knee joint cartilage cells with the mechanical typeⅡcollagenase digestion method.An in vitro culture system was established and the cell morphology was observed with an inverted phase contrast microscope.TypeⅡ immunohistochemistry method was used to identify the chondrocytes.By the second generation of in-vitro-cultured chondrocytes，ABPS（0，50，100，200 μg·mL-1 respectively）was used to interfere in the cartilage cells.After intervention，Western blot was used to detect the expression changes of typeⅡcollagen and proteoglycan of each group，and immunofluorescence was used to observe the expression changes of typeⅡcollagen respectively in the blank control group and the dosing group.Results：The morphology of the second generation chondrocytes showed that cartilage cells contained rich typeⅡcollagen.Western blot showed that ABPS promoted chondrocyte typeⅡcollagen and the expression of typeⅡcollagen was the highest when there was 100 μg·mL-1 ABPS，the difference being statistically significant（P < 0.05）.After intervention with 100 μg·mL-1 ABPS，the expression of proteoglycan in cartilage cells increased，but the difference was not statistically significant（P > 0.05）.Compared with the blank control group，the expression of intervened collagen typeⅡcollagen was stronger.Conclusion：ABPS promotes the expression of typeⅡcollagen and proteoglycan.
【Keywords】 osteoarthritis；achyranthes
bidentata polysaccharide；typeⅡcollagen；pr-oteoglycan；cartilage cell；rats
牛膝多糖（ABPS）是从苋科类植物牛膝的枯燥根中提取出来的有效成分。牛膝具有补肝肾、强筋骨、逐瘀通经、引血下行之成效[1-2]，被广泛应用于医治骨关节炎（osteoarthritis，OA）。OA是一种常见于中老年人的缓慢、进展性关节疾病，其最典型的病理特征是软骨退变，以Ⅱ型胶原与蛋白聚糖损坏丢掉、软骨胶原表型改动为首要病理改动[3-4]。关节软骨首要由软骨细胞和细胞外基质（ECM）组成[5-6]，构成ECM的首要成分是Ⅱ型胶原和蛋白聚糖。课题组前期研讨标明，ABPS促进了软骨细胞的增殖，因而，本文将讨论ABPS对软骨细胞Ⅱ型胶原及蛋白聚糖表达改动的
影响。
1 试验材料
1.1 试验动物 健康SD大鼠10只，雄性，4周龄，体质量200～300 g，由上海吴氏试验动物公司供给。试验动物合格证号：0001319。许可证号：SCXK（闽）2012-0001。大鼠分笼养殖，自在饮水，颗粒饲料喂食。
1.2 药 物 依照参考文献[7]研讨办法提取。提取的ABPS溶解在培育液中。
1.3 首要试剂 RIPA裂解液（强）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技能研讨所）；PVDF膜（美国Millipore公司）；TBST、转膜液、电泳液（北京普利莱基因技能有限公司）；一抗Ⅱ型胶原、一抗蛋白聚糖（Abcam）；二抗羊抗兔（北京中杉金桥生物技能有限公司）；DAB检测试剂盒（北京博士德公司）；DyLight 488 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）（艾美捷科技有限公司）。
1.4 试验仪器 超纯水设备（美国MILIPORE公司）；LX-800酶标仪（美国Bio-tek公司）；化学发光成像体系（美国Bio-RAD公司）；64R型低温高速离心机（美国BECKMAN公司）；激光共聚焦显微镜（德国ZEISS公司）。
2 方 法
2.1 关节软骨细胞的别离和培育 将10只SD大鼠脱颈法处死，无菌条件下刮下双侧膝关节外表软骨安排，1×PBS缓冲液漂洗3次，用眼科剪剪碎至1 mm3巨细；移至培育皿中，参加质量分数为
0.2%的Ⅱ型胶原酶5 mL，置于37 ℃培育箱中消化2 h；接着用200目尼龙网筛过滤；然后放入1000 r·min-1离心机离心5 min，弃上清液，将沉积的细胞团块用培育液制成细胞悬液；再将未消化彻底的安排如此操作2次。将3次所得的细胞悬液质量分数为1×105·mL-1，接种于培育瓶中，放入体积分数为5%的CO2培育箱中培育。每2～
3天替换1次培育基，倒置相差显微镜调查细胞生长状况，待80%的细胞融合后进行传代培育。细胞生长单层铺满培育瓶后，用质量分数为0.25%的胰蛋白酶消化2～3 min，待镜下细胞圆缩时，用尖吸管吹打细胞使其悬于液体中，加质量分数为10%的FBS培育液停止消化，分瓶，加质量分数为10%的FBS培育。第2代（P2）软骨细胞分为空白组和ABPS组，空白组不加ABPS干涉，ABPS组分别参加50，100，200 μg·mL-1的ABPS干涉48 h[8]。
2.2 软骨细胞判定 P2软骨细胞接种于细胞爬片上，培育48 h，PBS冲刷，丙酮固定10 min，浸入质量分数为0.75%的H2O2-PBS 37 ℃处理30 min，PBS振洗2次，每次3 min；参加关闭血清，37 ℃
关闭30 min，弃去血清，参加Ⅱ型胶原一抗，37 ℃孵育2 h，PBS振洗3次，每次3 min，生物素化山羊抗兔IgG 37 ℃效果20 min，PBS冲刷
2 min，3次；链霉亲和素-过氧化物酶复合物置于室温30 min，PBS冲刷5 min，4次；DAB显色，水洗
5 min，浸入苏木素染液2 min，水洗，脱水，通明，
封片。阴性对照组不参加Ⅱ型胶原一抗孵育。
2.3 Western blot 参照试剂阐明书，分组提取总蛋白，选用BCA法测定蛋白浓度。①质量分数为12%的SDS-PAGE胶每孔加20 μg变性后蛋白，60 V恒压至电泳超越浓缩胶后，90 V恒压至电泳完毕。②PVDF膜无水甲醇活化10 min，PVDF膜、胶、滤纸，转膜液平衡10 min。③由下到上：滤纸-胶-PVDF膜-滤纸次序，制造“三明治”夹，100 V恒压条件转膜。④转膜完结的PVDF膜，TBST荡洗后质量分数为5%的脱脂奶粉室温关闭2 h，相应一抗孵育，4 ℃摇床摇摆过夜。⑤TBST洗3次，每次10 min，参加相应二抗，室温摇床孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min。⑥PVDF膜蛋白面朝上放置，参加适量ECL显色液，反响2 min，
剖析得出成果。
2.4 免疫荧光染色 将软骨细胞分为空白组及ABPS组，ABPS组中参加含ABPS 100 μg·mL-1的彻底培育基。干涉48 h后，去除培育基，PBS洗3次；多聚甲醛室温固定10 min，PBS洗3次；质量分数为1%的Triton X-100室温通透10 min，PBS洗3次；质量分数为5%的羊血清室温关闭1 h，Ⅱ型胶原抗体4 ℃孵育过夜；PBS洗3次，羊抗兔荧光二抗37 ℃孵育1 h，DAPI染色5 min，PBS洗5～6次。
2.5 统计学办法 选用SPSS 20.0软件进行统计剖析。计量材料以标明，选用单因素方差剖析（One-Way ANOVA）或Student's t-test。以P < 0.05为差异有统计学含义。
3 结 果
3.1 体外培育的软骨细胞形状 从大鼠膝关节经屡次酶消化别离所得成骨细胞在倒置相差显微镜下调查，原代（P0）的软骨细胞具有小而圆的特征，经过2 d的培育，细胞的体积变大，少数的细胞开端拉长；3 d后，细胞具有梭型或许椭圆形的特征；到第5天细胞簇开端生长。第1代（P1）及P2细胞生长更为敏捷。见图1。
3.2 体外培育的软骨细胞的判定 P2软骨细胞的形状学标明软骨细胞的典型特征：软骨细胞含有丰厚的Ⅱ型胶原。与阴性对照组比较，干涉后的软骨细胞中细胞质染色棕色，这标明软骨细胞具有丰厚的Ⅱ型胶原蛋白表达。见
图2。
3.3 Western blot检测成果 与空白组比较，ABPS组中的Ⅱ型胶原表达量添加，其间以
100 μg·mL-1ABPS对软骨细胞干涉时Ⅱ型胶原的表达最高，差异有统计学含义（P < 0.05）（图3、
含义（P > 0.05）。
3.4 免疫荧光成果 2组软骨细胞核DAPI染色显着，呈蓝色（图6A1-A2），软骨细胞Ⅱ型胶原染色显着，呈绿色（图6B1-B2），细胞核与Ⅱ型胶原的组成图，结构明晰（图6C1-C2）。与空白组比较，ABPS组的细胞核染色显着，Ⅱ型胶原的荧光表达更强。能够阐明100 μg·mL-1 ABPS干涉的软骨细胞的活性、Ⅱ型胶原的表达都得到了增强。
4 讨 论
氨基葡萄糖是医治OA的常用药物，具有必定的效果。研讨发现，氨基葡萄糖能够促进蛋白多糖的组成，按捺蛋白多糖及胶原的降解，推迟OA的进程[9]。但是近年来发现，长期运用氨基葡萄糖会造生长链脂肪酸及过氧化物的积累，对OA的医治发作相反的效果[10]。而ABPS是一种具有广泛生物活性的高分子多糖，因在医治疾病中具有重要效果而引起广泛的重视。课题组前期的成果标明，ABPS能够促进软骨细胞的增殖[8，11]。因而，ABPS可能是一种潜在新式的医治OA的药物。
关节软骨的胶原蛋白首要以Ⅱ型胶原为主，占软骨胶原总量的90%～95%。Ⅱ型胶原经过屡次集合，在软骨内构成三维网状结构，一起与蛋白多糖链接、环绕，构成了使软骨具有弹性力的纤维网，起到固定蛋白多糖以及保持安排结构和张力稳定的效果。Ⅱ型胶原蛋白构成的网状结构遭到损坏被认为是OA的重要环节，软骨的这种结构结构遭到损坏然后引发软骨生物力学、生物化学等一系列变
化[12-14]。因而促进Ⅱ型胶原表达，在必定程度上能够缓解OA进程。本试验Western blot的成果标明，ABPS促进了软骨细胞Ⅱ型胶原的表达，而且
100 μg·mL-1时表达最高。免疫荧光成果标明，ABPS能够显着添加软骨细胞中Ⅱ型胶原的
表达。
蛋白聚糖是关节软骨ECM的首要大分子成分，在保持软骨正常功用及ECM的结构上具有重要效果[15]。在OA中，蛋白聚糖的过度降解和丢掉是软骨代谢失衡中最早发作的代谢改动。跟着OA病理改动呈现，蛋白聚糖的降解继续存在，则会进一步引起关节软骨胶原的过度降解及细胞表型的改动。而软骨细胞的表型改动，又能导致蛋白聚糖代谢的反常添加，跟着细胞功用的损失，蛋白聚糖的分化加速，而且多于组成，终究导致蛋白聚糖的很多丢掉。因而，促进蛋白聚糖的表达对医治OA具有重要效果[16]。本试验研讨成果发现，ABPS在100 μg·mL-1时能够促进蛋白聚糖的组成，标明ABPS可经过促进蛋白聚糖的表达按捺软骨退变。
本试验经过对大鼠软骨细胞进行ABPS干涉发现，ABPS具有促进大鼠软骨细胞Ⅱ型胶原与蛋白聚糖表达的效果，提示ABPS能够经过促进软骨细胞ECM排泄来按捺软骨退变。
5 参考文献
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收稿日期：2016-07-13；修回日期：2016-08-29
