刘静 谢克琴 曹跃鹏 刘正奇 邓志勇 李贺 孙贵炎 吕宁霁 马武开 钟琴
【摘 要】意图：研讨急性痛風性关节炎患者外周血Toll样受体2（TLR2）、Toll样受体4（TLR4）、髓样分解因子88（MyD88）的表达及其与中医证型的联系，为中医学的辨证论治供给客观根据。办法：将66例急性痛风性关节炎患者根据中医辨证分型分为湿热蕴结型48例，痰浊阻滞型6例，瘀热阻滞型10例，肝肾阴虚型2例。一起随机选取健康体检者20例为健康对照组。检测C-反响蛋白（CRP）、红细胞沉降率（ESR）水平，经过ELISA检测外周血中TLR2、TLR4、MyD88的浓度；选用SPSS 22.0软件剖析急性痛风性关节炎患者外周血TLR2、TLR4、MyD88与不同中医证型的联系。成果：①急性痛风性关节炎患者外周血TLR2、TLR4、MyD88浓度较健康对照组显着升高（P < 0.01）。②痛风性关节炎患者外周血TLR2与ESR、CRP呈正相关（P < 0.01）。③各中医证型的痛风性关节炎患者男性所占份额显着大于女人；在年纪方面，4个证型的痛风患者差异无统计学含义（P > 0.05）。④湿热蕴结型痛风性关节炎患者外周血ESR、CRP值显着高于其他3型，差异有统计学含义（P < 0.01）。⑤TLR2在各证型之间两两比较，差异有统计学含义（P < 0.01）。TLR4、MyD88在肝肾阴虚型与瘀热阻滞型之间比较，差异无统计学含义（P > 0.05）；其他各证型之间两两比较，差异有统计学含义（P < 0.05）。定论：TLR2、TLR4、MyD88能够反映痛风性关节炎的炎症轻重。湿热蕴结型痛风患者炎症反响更为活泼，与急性痛风性关节炎密切相关。
【要害词】 痛风性关节炎；中医证型；Toll样受体；髓样分解因子88；辨证论治
【ABSTRACT】Objective：To study the expressions of TLR2，TLR4 and MyD88 in peripheral blood of patients with acute gouty arthritis and their relationship with TCM syndrome patterns，so as to provide objective basis for TCM syndrome differentiation and treatment.Methods：Sixty cases of acute gouty arthritis，according to TCM syndrome，were divided into the damp-heat-accumulation syndrome pattern（48 cases），the phlegm-turbidity-blockage syndrome pattern（6 cases），the stasis-heat-accumulation syndrome pattern（10 cases），and the liver-kidney-yin-deficiency syndromepattern（2 cases）.At the same time，20 healthysubjects were randomly selected as the healthycontrol group.The levels of C-reactive protein（CRP）and erythrocyte sedimentation rate（ESR）were detected.The concentrations of TLR2，TLR4 and MyD88 in peripheral blood were detected by ELISA.The relationships between TLR2，TLR4 and MyD88 in peripheral blood and different TCM syndromes were analyzed by software SPSS 22.0.Results：①The concentration of TLR2，TLR4 and MyD88 in the peripheral blood of patients with acute gouty arthritis was significantly higher than that in the healthy control group（P < 0.01）.②There was a positive correlation between TLR2 and ESR and CRP in patients with gouty arthritis（P < 0.01）；③The proportion of men with gouty arthritis in all TCM syndrome patterns was significantly larger than that in women.In terms of age，there was no statistically significant difference in four syndrome patterns（P > 0.05）.④ESR and CRP values in peripheral blood of the damp-heat-accumulation syndrome pattern was significantly higher than that in the other three syndrome patterns，and the difference was statistically significant（P < 0.01）.⑤The difference was statistically significant（P < 0.01）between each two syndrome patterns.There was no significant difference of TLR4 and MyD88 between the liver-kidney-yin-deficiency syndrome pattern and the stasis-heat-accumulation syndrome pattern（P > 0.05）.There was a significant difference between each two syndrome patterns（P < 0.05）.Conclusion：TLR2，TLR4 and MyD88 can reflect the severity of gouty arthritis.Inflammation in the stasis-heat-accumulation syndrome pattern is more active and closely related to acute gouty arthritis.
【Keywords】 gouty arthritis；TCM syndrome pattern；TLRs；MyD88；syndrome differentiation and treatment
单钠尿酸盐（MSU）结晶在关节软骨、滑膜及周围安排等堆积而引发非特异性炎症反响，是急性痛风性关节炎的典型特色。MSU是一种内源性风险信号相关分子（DAMPs），被机体辨认后经过固有免疫引起炎症和细胞凋亡[1]。有关急性痛风性关节炎的机制研讨显现：Toll样受体（TLRs）介导的通路和髓样分解因子88（MyD88）依靠的白细胞介素（IL）-1受体途径与尿酸钠结晶引起的急性炎症有关，单核巨噬细胞的细胞膜外表存在Toll样受体2（TLR2）和Toll样受体4（TLR4），能够辨认细胞外的MSU晶体，并诱导IL-1β前体的转录，然后发作一系列炎症级联反响[2]。TLRs经过辨认相应的配体，并与之结合，再经过MyD88和干扰素TIR结构域联接蛋白（TRIF）依靠性途径（非MyD88依靠性途径）下传信号，激活核转录因子-κB（NF-κB）和激活蛋白1（AP-1），发动相关靶基因的转录，快速激活致炎因子IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、干扰素（IFN）、趋化性细胞因子、黏附分子、环氧化酶-2（COX-2）和诱生型一氧化氮合成酶的转录，这些酶的产品和细胞因子在炎症反响中发挥要害效果[3-10]。因而，TLR/MyD88信号通路是一个具有多种调理功用的传导通路，在痛风性关节炎的炎症反响进程中起重要效果[11]。
该研讨以急性痛风性关节炎的发病机制及中医辨证论治理论为辅导，剖析急性痛风性关节炎的中医证型与发病机制之间的内在联系，构建中医理论与现代科学技能、微观辨证与微观目标、辨病与辨证相结合的学术思想，然后在新的研讨技能和办法引进的条件下或许有用地前瞻研讨中医证型相关基因与中医辨证等杂乱的科学问题。检测痛风性关节炎外周血TLRs/MyD88信号试验室目标，讨论其与中医证型间的联系，对知道痛风中医证型与关节炎的发作机制具有重要的临床含义，能够为中医辨证供给客观根据，对中医证型的客观化供给理论根据。
1 材料与办法
1.1 临床材料 搜集2015年12月至2016年10月在贵阳中医学院第二隶属医院风湿免疫科就诊的门诊和住院急性痛风性关节炎患者66例，男63例，女3例；年纪21～69岁，均匀（48.76±9.20）岁。一切患者均契合2015年美国风湿病学会（ACR）/欧洲抗风湿病联盟（EULAR）提出的痛风分类规范[12]。健康对照组随机抽取贵阳中医学院第二隶属医院体检中心健康者20例，男19例，女1例；年纪24～69岁，均匀（46.70±13.44）岁。2组在性别、年纪等方面比较，差异无统计学含义
（P > 0.05），具有可比性。操作流程契合贵阳中医学院第二隶属医院人体试验委员会道德审阅规范。参加者均签署知情同意书；扫除严峻心脑血管疾病及兼并其他风湿免疫性疾病者。
1.2 试验仪器及试剂 三重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂）；-20 ℃冰箱、4 ℃冰箱（中科美菱）；低温高速离心机（美国Thermo Forma公司）；超净工作台（苏洁净化有限公司）；酶标仪（美国BioTek公司）；电热恒温水域箱（天津泰斯特仪器有限公司）；微量移液枪（德国eppendorf公司）；洗板机（凯特生物医疗电子科技有限公司-KWP-100A）；血沉仪（越华XC-A3A）；全自动生化剖析仪（日本TOSHIBA公司）；TLR4 ELISA试剂盒（上海劲马生物科技有限公司，JM1062582）；TLR2 ELISA试剂盒（上海劲马生物科技有限公司，JM1062653）；MyD88 ELISA试剂盒（上海劲马生物科技有限公司，JM1062577）。
1.3 查询目标 ①一般临床信息：年纪、性别等。②收集患者的临床症状、体征、舌脉等，进行中医辨证分型，参照痛风的确诊根据、证候分类、效果鉴定—中华公民共和国中医药行业规范《中医内科病证确诊效果规范》（ZY/T001.1-94）[13]分为4个证型。其间湿热蕴结型48例，痰浊阻滞型6例，瘀热阻滞型10例，肝肾阴虚型2例。
③炎症目标：一切病例均清晨空腹肘部静脉采血，分别用惯例抗凝管、生化管收集5 mL静脉血，随即送往贵阳中医学院第二隶属医院查验科检测
C-反响蛋白（CRP）和红细胞沉降率（ESR）。④空腹收集患者静脉血进行离心分离血清，放于-20 ℃冰箱保存，供ELISA检测患者外周静脉血TLR2、TLR4、MyD88的浓度，依照试剂盒阐明书进行操作。
1.4 统计学办法 选用SPSS 22.0软件进行统计剖析。计量材料以标明，契合正态散布，满意方差齐性，2组间比较选用独立样本t查验，多组间样本材料选用单要素方差剖析；不契合正態散布选用非参数（秩和）查验；计数材料选用χ2查验。以P < 0.05为差异有统计学含义。
2 结 果
2.1 各中医证型性别、年纪散布状况 各证型痛风患者男性所占份额显着大于女人。4个证型的痛风患者在年纪上比较，差异无统计学含义（P > 0.05）。见表1。
2.2 各中医证型ESR、CRP的联系 湿热蕴结型痛风患者外周血ESR、CRP值显着高于痰浊阻滞型、瘀热阻滞型、肝肾阴虚型，差异有统计学含义（P < 0.01）。见表2。
2.3 TLR2、TLR4、MyD88与炎症目标的相关性剖析 各目标经查验后呈偏态散布，选用Spearman查验剖析其相关性，成果提示，痛风患者外周血TLR2与ESR、CRP呈线性正相关（P < 0.01）。见表3。
2.4 痛风组与健康对照组TLR2、TLR4、MyD88的比较 痛风组患者外周血TLR2、TLR4、MyD88的质量分数显着高于健康对照组，差异有统计学含义（P < 0.01）。见表4。
2.5 各中医证型TLR2、TLR4、MyD88的比较 TLR2在各证型之间两两比较，差异有统计学含义（P < 0.01）。TLR4、MyD88在肝肾阴虚型与瘀热阻滞型之间比较，差异无统计学含义（P > 0.05）。其他各证型之间两两比较，差异有统计学含义（P < 0.05）。见表5。
3 讨 论
3.1 急性痛风性关节炎与TLR2、TLR4、MyD88 TLRs是Ⅰ型跨膜蛋白受体，包括胞外区、跨膜区、胞内区，胞外区含有不同长度的亮氨酸重复区域，参加配体的辨认；细胞内羧基结尾包括一个保存部位，与IL-1受体类似，被称为Toll/IL-1受体结构域（TIR），依靠TIR的嗜同性效果和下流接头蛋白的TIR结合来传导信号[14]。MyD88是Toll/IL-1R宗族和逝世结构域的宗族成员，有TIR的结构域，为TLRs信号通路中要害性的一个接头分子，TLRs辨认相应配体，经过MyD88依靠途径及其非依靠途径进行信号转导。MyD88依靠性信号传导途径为TLR信号传导的共有通路，能够和TIR宗族胞内的TIR结构域相互效果，在传递上游信息和疾病发作展开中起承上启下传导激活信号的效果，导致下流多种转录因子的激活，促进炎性基因和其他机体防护蛋白的转录，终究发动先天性免疫应对[15]。TLRs经过辨认相应的配体，激活机体并发作免疫应对，在固有免疫、炎症因子发作及信号传递中发挥着重要效果[16]。高尿酸血症是发作痛风的生化根底，但只要5%～12%的高尿酸血症患者会终究展开成痛风。高尿酸血症展开成痛风的机制研讨：IL-β是MSU晶体诱导炎症的要害因子，而TLR2和TLR4能够辨认细胞外的MSU晶体，诱导IL-β前体的转录[17]。TLRs是决议MSU晶体堆积引起急性痛风性关节炎的主要要素，TLRs/MyD88信号通路参加急性痛风性关节炎的炎症反响进程。近年来，多项研讨也均标明，TLR2、TLR4、MyD88在痛风发病中起着重要效果。蒋莉等[3]研讨发现，TLR4 mRNA、急性痛风性关节炎组NF-κB显着高于痛风性关节炎非急性组和正常对照组。刘丽琼等[18]试验研讨发现，TLR2、TLR4、MyD88、NF-κB基因的表达水平急性炎症小鼠模型中显着添加。FU?BROICH等[19]使用脂多糖（LPS）影响单核细胞MUTZ-3细胞树立炎症模型，成果发现，炎性细胞的TLR2和TLR4的表达显着添加。在一项关于痛风康Ⅱ号颗粒对急性痛风性关节炎TLRs/MyD88通路影响的研讨中发现，在急性痛风性关节炎模型大鼠关节滑膜安排中TLR2、TLR4、MyD88的表达较正常关节滑膜安排显着增多（P < 0.01）[20]。以上国内外许多研讨均阐明TLR2、TLR4、MyD88在急性痛风性关节炎的发作、展开中起着不行忽视的效果。
3.2 中医证型与痛风性关节炎 李远上等[21]临床查询认为中医辨证分型医治痛风性关节炎能够有用改进患者症状、试验室目标，进步临床效果。刘佳等[22]对百余篇论文进行总结概括，痛风性关节炎的中医临床辨证分型主要有湿热、痰浊、血瘀、寒湿、肝肾亏虚、脾虚6型。黄女娜[23]经过回忆性研讨剖析203例痛风性关节炎患者的中医证候特色，分为脾虚湿瘀证、湿热蕴结证、肝肾阴虚证、瘀热阻滞证，其间急性痛风性关节炎以湿热蕴结证为主。中医辨证不过寒热真假两头，痛风性关节炎的病因多为寒、热、虚、实（湿、痰、瘀）等。经过许多文献收拾发现，痛风性关节炎的辨证分型颇多，各家定见不同，没有共同的辅导规范。所以应进一步加强对本病的中医辨证论治规则讨论和研讨，尤其是剖析能否结合相关客观目标进行辨证，使中医证型客观化，对临床有重要辅导含义。只要与西医学紧密结合，辨病与辨证结合，互为补充，更为客观地知道疾病、辅导医治，才干从根本上提高中医药医治痛风性关节炎效果及研讨水平，并有益于进一步广泛推行。
3.3 急性痛风性关节炎中医证型与一般材料的联系 本研讨发现急性痛风性关节炎的发病以男性居多，且发病年纪越来越年轻化。痛风性关节炎是一种代谢性疾病，国内外很多流行病学查询均显现其发病率呈逐年上升趋势，各年纪段均可发病，发病越来越年轻化。痛风性关节炎发病率男性高于女人，男女之比约为20∶1[24]。女人发病率较低与性激素效果有关，发病年纪或许与宗族遗传史、生活习惯等有关[25]。一切归入病例湿热蕴结型最多，占72.73%，肝肾阴虚型所占份额最小，为3.03%。临床上痛风性关节炎一般分为急性期、间歇期、缓解期，急性痛风性关节炎患者以湿热蕴结型为主，这与既往研讨相契合。
3.4 急性痛风性关节炎中医证型与炎症的联系 ESR、CRP现在被遍及认为是炎症进程中的急性时相反响物。本研讨4种证型的ESR、CRP均匀值均高于正常值，阐明不同证型的痛风性关节炎患者均存在不同程度的炎症。4个证型CRP、ESR比较，湿热蕴结型均高于痰浊阻滞型、瘀热阻滞型、肝肾阴虚型。这与既往的研讨成果共同[26]。湿热蕴结，阻滞经络，正邪交争剧烈，炎癥反响激烈，体现出湿热之邪在痛风性关节炎病况活动中的重要效果，这阐明湿浊、热毒既是痛风性关节炎的致病要素，也是其展开的代谢产品，能够为临床中医辨证医治痛风供给客观根据。
3.5 急性痛风性关节炎中医证型与TLR2、TLR4、MyD88的联系 TLR2、TLR4及其联接蛋白MyD88参加了MSU晶体的辨认，并诱导免疫细胞对MSU的吞噬及细胞炎性因子的发作，参加急性痛风性关节炎的发作、展开[27-29]。本研讨发现急性痛风性关节炎患者外周血TLR2、TLR4、MyD88的浓度显着升高，并与炎症目标ESR、CRP呈正相关，这进一步证明TLR2、TLR4、MyD88参加急性痛风性关节炎的发作、展开。急性痛风性关节炎的辨证多为湿热蕴结型[30]，国内外很多研讨均标明TLR2、TLR4、MyD88与炎症反响密切相关[17-20]。本研讨成果提示，急性痛风性关节炎患者以湿热蕴结型为主，TLR2、TLR4、MyD88与急性痛风性关节炎患者的发病相关，其间湿热蕴结型患者相关性最高，或许是湿热蕴结型患者的炎症反响最重。
综上所述，TLR2、TLR4、MyD88能够反映急性痛风性关节炎的炎症轻重。湿热蕴结型患者炎症反响更为活泼，与急性痛风性关节炎的严峻程度密切相关。本研讨为痛风性关节炎中医证型的客观化供给了理论根据，临证时，能够在传统四诊合参的根底上参加患者的客观目标，以更好地辅导医治、挑选药物。但本研讨存在样本量缺乏、规模限制等问题，有待展开多中心、大样本的剖析研讨来进一步深化了解客观目标与中医证型的相关性。
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