庞学丰++刘莎莎++李玉玲++刘欢++蒙宇华++姚平++冯玉青++吴燕红++唐丽萍
【摘 要】意图：调查清热解毒抗风湿方药——热痹康汤对胶原诱导性关节炎（CIA）大鼠滑膜血管内皮生长因子（VEGF）的影响。办法：将60只清洁级雌性Wistar大鼠随机分为空白对照组，模型对照组，甲氨蝶呤组，热痹康汤低、中、高剂量组，每组10只。除空白对照组外，其他各组大鼠选用弗氏不彻底佐剂联合牛Ⅱ型胶原蛋白诱导CIA大鼠模型。造模成功后开端给药，模型对照组给予生理盐水灌胃，热痹康汤低、中、高剂量组别离给予热痹康汤提取物低、中、高剂量灌胃，甲氨蝶呤组给予甲氨蝶呤灌胃，空白对照组大鼠自在饮水和进食。调查不同剂量热痹康汤对CIA大鼠的关节肿胀指数及其滑膜VEGF的影响。成果：热痹康汤各剂量组及甲氨蝶呤组大鼠的关节肿胀指数均低于模型对照组（P < 0.01），其间中剂量热痹康汤效果与甲氨蝶呤适当（P > 0.05），高剂量热痹康汤效果优于甲氨蝶呤（P < 0.01）；热痹康汤各剂量组及甲氨蝶呤组大鼠滑膜的VEGF水均匀低于模型对照组（P < 0.05），其间高剂量热痹康汤效果优于甲氨蝶呤（P < 0.05），中、低剂量热痹康汤效果与甲氨蝶呤适当（P > 0.05）。定论：热痹康汤医治类风湿关节炎的机制是经过按捺滑膜VEGF的发生而完结的。
【关键词】 胶原诱导性关节炎；关节炎，类风湿；热痹康汤；血管内皮生长因子；大鼠
Effect of Rebikang Tang（热痹康汤）on Vascular Endothelial Growth Factor in Rats with Collagen-induced Arthritis
PANG Xue-feng，LIU Sha-sha，LI Yu-ling，LIU Huan，MENG Yu-hua，YAO Ping，FENG Yu-qing，WU Yan-hong，TANG Li-ping，LEI Zong-shang，SHU Jian-long，WANG Si-chao，DU Yong-yi，LIN Ju
【ABSTRACT】Objective：To observe the effect of Rebikang Tang（热痹康汤—a prescription of clearing away heat and toxic materials and anti-rheumatism）on vascular endothelial growth factor（VEGF）in rats with collagen-induced arthritis（CIA）.Methods：Sixty clean-grade female Wistar rats were randomly divided into a blank control group，a model control group，a methotrexate group，and low，medium and high-dose Rebikang Tang groups，10 rats in each group.Except the blank control group，the rats in the other groups were induced by the incomplete adjuvant combined with collagen typeⅡto establish CIA rat models.The model control group was given intragastric administration of physiological saline，the low，medium and high-dose Rebikang Tang groups were given corresponding dose of Rebikang Tang，the methotrexate group was given intragastric administration of methotrexate and the rats in the control group could drink water and eat food freely.The effects of different doses of Rebikang on joint swelling index and VEGF were observed.Results：The joint swelling indexes in each dose of Rebikang group and the methotrexate group were lower than that of the model group（P < 0.01），among which the effect in the medium-dose Rebikang group was equivalent to that of the methotrexate group（P > 0.05） and the effect in the high-dose Rebikang group was superior to that of the methotrexate group（P < 0.01）.The synovial VEGF levels in each Rebikang group and the methotrexate group were lower than that of the model control group
（P < 0.05），among which the effect of the high-dose Rebikang group is superior to the methotrexate（P < 0.05），
while the effects of the middle and low-dose Rebikang groups were equivalent to the methotrexate（P > 0.05）.Conclusion：The mechanism of Rebikang Tang in the treatment of rheumatoid arthritis can be achieved by inhibiting the generation of VEGF.
【Keywords】 collagen-induced arthritis；arthritis，rheumatoid；Rebikang Tang（热痹康汤）；vascular endothelial
growth factor；rats
类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种首要侵略外周关节的缓慢本身免疫性疾病。不经标准医治的晚期RA患者会呈现关节变形和功用损失[1]，血管内皮生长因子（VEGF）在RA的发病、发展中起到重要的效果。本研讨经过给予CIA大鼠灌服清热解毒抗风湿方药——热痹康汤，讨论其对CIA大鼠滑膜VEGF的影响。
1 试验材料
1.1 试验动物 清洁级雌性Wistar大鼠60只，体质量（110±10）g，购于广西中医药大学试验动物中心。动物合格证号：桂医动字第11005号。养殖在空气流通、温度约22～25 ℃、湿度适中（不低于40%）的安静动物房内。
1.2 试验试剂 牛Ⅱ型胶原蛋白、弗氏不彻底佐剂（美国Chondrex公司）；检测VEGF所需试剂盒（南京建成生物工程研讨所）。
1.3 试验药物 本院新药研制中心担任制备供给本试验研讨所用的热痹康汤提取物，将热痹康汤（原药）提取制成含有活性部位的浸膏（由本院新药研制中心担任制造）。造模时按份额参加乙醇和生理盐水溶解配制成质量分数为2×10-7 g·L-1的溶液供大鼠造模。甲氨蝶呤片购自上海医药（集团）有限公司信谊制药总厂。
2 方 法
2.1 分组与造模 将60只清洁级Wistar雌性大鼠放置于鼠笼中进行适应性喂食，调查7 d无反常后随机分为模型对照组，甲氨蝶呤组，热痹康汤低、中、高剂量组，每组10只。除空白对照组外，其他各组大鼠按过程别离进行造模（办法参照文献[2]）：试验时于无菌条件下，在冰面大将牛Ⅱ型胶原蛋白充沛溶解于冰醋酸中，接着参加相同体积的弗氏不彻底佐剂，随后一同注入医用三通管内，用打针器相互推吸以充沛混合乳化，制成油包水状的CⅡ乳剂，完结后把它放置于4 ℃的冰箱进行保存。进行造模时，别离将CⅡ乳剂分多点打针于Wistar大鼠的背部和尾部皮内。打针后调查大鼠14 d，无反常后再次打针CⅡ乳剂（所用办法和药物剂量同前所述）进行免疫。
2.2 给药医治 按70 kg人体质量与200 g大鼠换算系数为0.018，甲氨蝶呤组大鼠按甲氨蝶呤药液
2.7 mg·kg-1进行灌胃，每周1次；热痹康汤高剂量组大鼠给予31.25 g·（100 g）-1·d-1的热痹康汤提取物进行灌胃，中剂量组大鼠给予15 g·（100 g）-1·d-1
的热痹康汤提取物进行灌胃，低剂量组大鼠给予
7.5 g·（100 g）-1·d-1的热痹康汤提取物进行灌胃，每日分2次灌服；模型对照组大鼠给予生理盐水
2 mL·（100 g）-1灌服，每日1次。空白对照组大鼠不约束饮水，自在进食。
2.3 关节肿胀指数评分 医治前及医治后第1，2，4周别离做好各组大鼠关节肿胀指数的调查并具体记载。评分4分及以上即为造模成功（评分标准参考文献[3]进行拟定：其间表现为包含踝关节在内的悉数关节肿胀者评为4分，选取造模成功的大鼠进行下一阶段试验）。
2.4 滑膜VEGF的检测 除空白对照组外，其他各组大鼠均按方案给药。4周后一切大鼠均选用水合氯醛腹腔打针进行麻醉，麻醉彻底后于无菌条件下在膝关节处快速剥离滑膜安排，放置于-20 ℃冰箱保存备测。选用免疫组化法测定滑膜中的VEGF含量，项目检测过程及办法严厉按试剂盒说明书进行。
2.5 统计学办法 选用SPSS 17.0软件进行统计分析。计量材料以标明，2组间效果比较选用t查验，各组间的效果比较选用方差分析。以
P < 0.05为差异有统计学含义。
3 结 果
3.1 各组大鼠医治前后关节肿胀指数比较 与模型对照组比较，各医治组大鼠关节肿胀指数医治
2周后均有下降，其间热痹康汤高、中剂量组及甲氨蝶呤组与模型对照组比较，差异有统计学含义
（P < 0.01）。各医治组大鼠关节肿胀指数医治
4周后与模型对照组比较，差异有统计学含义
（P < 0.01），其间热痹康汤中剂量组效果与甲氨蝶呤组适当（P > 0.05），热痹康汤高剂量组效果优于甲氨蝶呤组（P < 0.01）。见表1。
3.2 各组大鼠医治前后滑膜VEGF改变比较
各组大鼠滑膜VEGF水平显着高于空白对照组（P < 0.01）；各给药组大鼠医治4周后的滑膜VEGF水平与模型对照组比较，差异有统计学含义（P < 0.05）。热痹康汤中、低剂量组与甲氨蝶呤组效果适当，差异无统计学含义（P > 0.05）；
热痹康汤高剂量组与甲氨蝶呤组比较，差异有统计学含义（P < 0.05）。见表2。
表2 各组大鼠医治前后滑膜VEGF改变比较
组别 动物数（只） VEGF（%）
空白对照组 10 4.52±0.46
模型对照组 10 29.75±3.131）
甲氨蝶呤组 10 23.25±1.751）2）
热痹康汤低剂量组 10 22.62±1.821）2）
热痹康汤中剂量组 10 21.84±1.711）2）
热痹康汤高剂量组 10 17.61±1.671）2）3）
注 与空白对照组比较，1）P < 0.01；与模型对照组比较，2）P < 0.05；与甲氨蝶呤组比较，3）P < 0.05
4 讨 论
RA的发病和病况发展过程中，血管翳的构成会导致关节的损坏、变形以及功用障碍，而血管翳构成的重要环节之一就是血管重生。VEGF在RA的发病、发展中起到非常重要的效果。有一项研讨将RA患者与健康人群及退行性骨关节炎患者进行比照，成果发现，RA患者血清中VEGF水平显着升高，而且发现其与炎性目标、类风湿因子以及病况的严峻程度呈正相关，笔者以为能够把VEGF作为判别RA病况是否活动的一个目标[4-5]。有试验研讨证明，经向RA关节腔内打针VEGF抗体或其受体拮抗剂进行医治，能够减轻RA的症状以及显着按捺滑膜血管翳的构成[6]。近年来多方面的研讨成果现已标明，经过按捺VEGF的表达这一途径医治RA的研讨已逐步成为新的热门和方向之一。
RA属中医学“痹病”领域，多为机体衰弱，御邪才能低下，风寒湿热之邪侵略，痹阻于内，气血运转不畅，筋脉瘀阻而成。热痹康汤是课题担任人根据上述理论知道，结合多年临床经验总结出的经验方，由秦艽、防风、桂枝、威灵仙、制川乌、地龙、桑枝、葛根、忍冬藤、青风藤、黄柏、苍术组成，具有清热解毒、利湿除痹止痛成效，医治RA效果较好，能显着改进湿热型患者的晨僵、关节痛苦、关节压痛、关节肿胀及关节功用，下降患者血液中显着升高的C-反响蛋白、类风湿因子、红细胞沉降率以及免疫球蛋白等试验室目标，毒副效果较少，患者耐受程度较好[7]。已完结的动物试验研讨标明，热痹康汤能下降胶原诱导性关节炎大鼠血清中升高的白细胞介素-2、白细胞介素-1β、白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α及基质金属蛋白酶-3的水平[8-12]，提示热痹康汤能经过影响这些在RA的发病过程中起重要效果的促炎因子而到达医治的效果。
本试验成果标明，热痹康汤能够经过按捺VEGF的发生，按捺血管翳的构成以及滑膜增殖，减轻炎症而起到医治RA的效果，为进一步研讨热痹康汤的效果机制供给了试验根据。
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5 参考文献
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收稿日期：2016-09-13；修回日期：2016-10-25
